论文摘要
目的: 利用人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子的组织特异性,构建能增强逆转录病毒在人肿瘤细胞中靶向表达的载体,为进一步研究肿瘤基因治疗提供物质基础.方法: 一、pLXSN、phTERT-luc 质粒的鉴定: CaCl2方法制备大肠杆菌感受态细胞JM109,将所收集的以上质粒转化到JM109 菌株中,提取以上质粒DNA, 分别酶切,琼脂糖凝胶电泳证实. 二、phTERT-EGFP-N2 的构建: phTERT-luc 经SacI、BglII 双酶切,得到长334bp 的基因片段,插入到经SacI、BamHI 酶切的pEGFP-N2的载体中,T4DNA 连接酶连接, 4℃、16h, 连接产物转化JM109 菌株,提取质粒,酶切, 琼脂糖凝胶电泳筛选,鉴定. 三、PCR 扩增目的片段: 分别以phTERT-EGFP-N2、pEGFP-N2为模板,设计引物,分别PCR 扩增hTERT 启动子和EGFP 基因片段、EGFP 基因片段, 琼脂糖凝胶电泳,切胶,PCR 纯化试剂盒回收. 四、pLXSN-EGFP 的构建: 经PCR 扩增回收的EGFP 基因片段, 以EcoRI、Bgl II 分别单酶切后回收,插入到经EcoRI、BamHI 酶切的pLXSN 载体中, T4DNA 连接酶连接, 4℃、16h, 连接产物转化JM109 菌株,提取质粒,酶切, 琼脂糖凝胶电泳筛选,鉴定. 五、pLXSN-hTERT-EGFP 的构建: 经PCR 扩增回收的hTERT 启动子和EGFP 基因片段, 以EcoRI、BamHI 分别单酶切后回收,插入到经EcoRI, BamHI 酶切的pLXSN 载体中, T4DNA 连接酶连接, 4℃、16h, 连接产物转化JM109 菌株,提取质粒,酶切, 琼脂糖凝胶电泳筛选,鉴定.六、瞬时转染和EGFP 蛋白的表达: 用脂质体LipofectamineTM2000 介导phTERT-EGFP-N2,pEGFP-N2,pLXSN,pLXSN-EGFP, pLXSN-hTERT-EGFP 瞬时转染
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