源于水稻的链霉菌菌株F-1的鉴定及其防病潜力和防病机制研究

论文摘要

由Rhizoctonia solani引起的水稻纹枯病是水稻的重要病害之一,对于该病的生物防治已成为研究热点。植物的体围存在着一些微生物自然群体,它们中的有些种类,如链霉菌等对植物病原菌具有拮抗性,因而可将其作为生防菌来开发利用。评估拮抗菌的防病潜力是其开发利用的前提,而了解其防病机理是增强其防病能力的基础。本研究从健康水稻植株分离得到一个对水稻纹枯菌、灰霉菌和核盘菌等植物病原真菌有显著拮抗作用的链霉菌菌株F-1。在此基础上对菌株F-1的分类鉴定、防病潜力和防病机制进行了系统研究,结果如下:1.从湖北、湖南和山东等5个省的13个不同地区所采集的健康和感染水稻纹枯病的水稻植株上分离得到385个细菌菌株和2个链霉菌菌株。综合平板对峙培养和离体防病效测定的结果,筛选出对水稻纹枯菌有显著拮抗作用,对水稻纹枯菌侵染水稻叶片有显著抑制效果的链霉菌菌株F-1。2.采用传统分类鉴定方法和现代分子分子生物学鉴定方法相结合,菌株F-1鉴定为普特拉链霉菌（Streptomyces platensis F-1）。其16S rDNA序列已在GenBank数据库中注册,注册号为EF583557。3.在离体水稻叶片、水稻苗及盆栽水稻上测定了链霉菌F-1产生的抗菌物质（antifungal substance.AFS）对水稻纹枯病的防效,评估链霉菌F-1防病潜力。试验结果表明:用含有链霉菌F-1的培养物滤液(AFSPDB)处理水稻叶片或水稻植株,能有效的抑制水稻纹枯菌的侵染,使水稻纹枯病的发病严重度显著下降。例如,离体水稻叶片防效试验中,接种3d后,无菌水处理组的水稻叶片病害严重度达到2.2级,而用AFSPDB处理的水稻叶片病害严重度只有0.9级。对水稻纹枯菌的离体拮抗性测定试验表明,链霉菌F-1产生的AFS处理的水稻纹枯菌菌丝生长速度减慢,菌丝出肿胀、变形,褶皱等异常形态,尤其是顶端菌丝表现最为明显。4.研究了影响链霉菌F-1产生抗菌物质的因子及其抗真菌物质的基本属性。试验结果表明:链霉菌菌株F-1液体发酵3d后,其生物产量、抗菌物质产量即可达到高峰。适宜菌株F-1生长及抗菌物质产生的pH值范围在5～8,最适pH值为6～7。链霉菌F-1可以利用供试的8种碳源（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、肌醇山梨醇和甘露醇）进行菌丝生长,最适碳源是葡萄糖和麦芽糖。除乳糖外,链霉菌F-1可利用其余7种碳源产生抗菌物质,最适碳源是肌醇。链霉菌F-1可利用供试的6种氮源（硫酸铵、硝酸铵、尿素、碳酸铵、硝酸纳、硝酸钾）进行菌丝生长和产生抗菌物质。硫酸铵和硝酸铵适于F-1生长,而硝酸钾适于F-1产生抗菌物质。链霉菌F-1产生的抗菌物质对热敏感:对酸性环境不敏感,但碱性环境对其活性有影响;对紫外线照射抵抗;对蛋白酶K不敏感;对氯仿敏感;可被硫酸铵盐析沉淀下来;抑菌谱测定表明,F-1产生的抗菌物质的抑制对象具有选择性。除水稻纹枯菌之外,还能有效抑制灰霉菌、核盘菌、稻瘟菌和柑橘炭疽菌等。5.采用盐析沉淀及透析,以及Sephadex G-100柱层析法,从链霉菌F-1液体培养物中,分离到一种具抗菌作用的蛋白质,分子量约为33kDa。F-1菌落表面（或菌丝及孢子表面）、菌丝内和液体培养物滤液中均含有抗菌物质。6.发现链霉菌F-1产生的挥发性气体对水稻纹枯菌、核盘菌和灰霉菌的侵染具有显著的抑制效果。采用顶空固相微萃取技术和气质联用（GC/MS）分析法,鉴定出16种挥发性物质。这些物质可分为醇类、酯类、有机酸类、烷烃类、酮类和烯烃类。其中包括土腥味物质Geosmins和两种已知的抗真菌,苯乙醇和（+）-表双环倍半水芹烯。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 水稻纹枯病研究进展
• 1.1 水稻纹枯病的危害
• 1.2 水稻纹枯病的症状和发病规律
• 1.3 茄丝核菌的形态和基本生物学特性
• 1.4 水稻纹枯病的防治策略
• 1.5 对于水稻纹枯病的生物防治研究
• 2 利用链霉菌防治植物病害研究
• 2.1 链霉菌的基本特点及分类鉴定方法
• 2.2 链霉菌作为生防菌的优势
• 2.3 生防链霉菌的来源
• 2.4 链霉菌生防作用机制
• 3.抗真菌蛋白研究进展
• 3.1 抗真菌蛋白的类型及其作用机理
• 3.2 抗真菌蛋白质的研究展望
• 4.利用微生物产生的挥发性物质防治植物病害
• 5 本研究的意义和主要研究内容
• 5.1 课题的意义
• 5.2 课题的研究内容
• 第二章 水稻纹枯菌拮抗菌的分离与筛选
• 1.材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.3 水稻样品的采集
• 2.试验方法
• 2.1 水稻植株附生菌的分离与保存
• 2.2 拮抗菌筛选
• 2.3 离体水稻叶片初筛
• 2.4 离体水稻叶片复筛
• 3.结果与分析
• 3.1 水稻植株附生细菌的分离纯化
• 3.2 拮抗菌筛选
• 3.3 离体水稻叶片初筛结果
• 3.4 离体水稻叶片复筛结果
• 4.讨论
• 第三章 拮抗链霉菌菌株F-1的鉴定
• 1 供试材料与培养基
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.3 供试试剂
• 2 试验方法
• 2.1 形态学研究法
• 2.2 生理生化特征分析
• 2.3 16S rDNA鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 形态观察
• 3.2 培养特征
• 3.3 生理生化特征
• 3.4 16S rDNA序列测定及系统发育树分析
• 3.5 链霉菌F-1的定名
• 4 讨论
• 第四章 链霉菌F-1对水稻纹枯病防效测定及防病机制
• 1.供试材料及培养基
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试水稻品种
• 1.3 供试培养基
• 2.试验方法
• 2.1 试验前准备
• 2.2 链霉菌F-1对水稻纹枯病的离体防效测定
• 2.3 链霉菌F-1培养物滤液防治水稻纹枯病的活体防效测定
• 2.4 链霉菌F-1对水稻纹枯菌抑菌机理测定
• 3.结果与分析
• 3.1 链霉菌F-1对水稻纹枯病的离体防治效果
• 3.2 对水稻纹枯病活体防效测定
• 3.3 对水稻纹枯菌抑菌机理测定
• 4.讨论
• 第五章 链霉菌F-1产生的抗真菌物质的理化特性
• 1 材料,培养基和仪器设备
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 2.试验方法
• 2.1 影响链霉菌F-1产生抗真菌物质的因子分析
• 2.2 链霉菌F-1产生的抗真菌物质的理化特性
• 2.3 链霉菌F-1抗真菌物质抑菌谱测定
• 3.结果与分析
• 3.1 链霉菌F-1产生抗真菌物质的动态变化
• 3.2 链霉菌F-1抗菌物质理化特性
• 3.3 链霉菌F-1抗菌物质的抑菌谱
• 4 讨论
• 第六章 链霉菌F-1抗真菌蛋白分离纯化及初步定位
• 1.材料,培养基和仪器设备
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 2 试验方法
• 2.1 链霉菌F-1液体培养物滤液的制备
• 2.2 硫酸铵饱和度确定
• 2.3 蛋白质含量测定
• 2.4 Sephadex G-100凝胶过滤及层析
• 2.5 Sephadex G-100柱层析各组分的抑菌活性检测
• 2.6 抗真菌蛋白质的SDS-PAGE电泳分析
• 2.7 链霉菌F-1抗真菌蛋白的初步定位
• 3 结果与分析
• 3.1 硫酸铵盐析条件的确定
• 3.2 链霉菌F-1培养物滤液蛋白质含量
• 3.3 链霉菌F-1抗真菌蛋白质的分离及纯化
• 3.4 不同组分抑菌活性测定
• 3.5 抗真菌蛋白质的SDS-PAGE电泳分析
• 3.6 链霉菌F-1抗真菌蛋白的初步定位
• 4.讨论
• 第七章 链霉菌F-1产生的挥发性物质防病测定及鉴定
• 1.材料,培养基和仪器设备
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.3 试验仪器
• 2.试验方法
• 2.1 试验前准备
• 2.2 离体叶片上对水稻纹枯病防效测定
• 2.3 活性炭对挥发性物质防效影响测定
• 2.4 在水稻幼苗上防治水稻纹枯病测定
• 2.5 对油菜菌核病防效测定
• 2.6 对草莓灰霉病防效测定
• 2.7 对青椒储藏期病害防治测定
• 2.8 对病原菌菌菌丝生长的影响测定
• 2.9 挥发性物质成份鉴定
• 3.结果与分析
• 3.1 离体叶片上对水稻纹枯病防效测定
• 3.2 活性炭对挥发性物质防效影响测定
• 3.3 在水稻幼苗上防治水稻纹枯病测定
• 3.4 在油菜苗上对菌核病防效测定
• 3.5 在草莓果实上对灰霉病防效测定
• 3.6 对青椒储藏期病害防治测定
• 3.7 对病原菌菌丝生长影响测定
• 3.8 挥发性物质成份鉴定
• 4.讨论
• 第八章 结论、创新与展望
• 1 结论
• 2 创新
• 3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 个人简介
• 附录2 发表论文