家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm61、orf74的基因分析

论文摘要

杆状病毒是节肢动物特别是鳞翅目昆虫重要的病原微生物。到目前为止,已有47种杆状病毒完成了全基因组测序。序列分析发现,仅有30个基因在所有已经测序的杆状病毒中都存在,称为核心基因。在鳞翅目昆虫杆状病毒中,有62个基因是保守的。本研究以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）核心基因Bm61和非核心基因orf74为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能,从而为丰富杆状病毒分子生物学提供理论基础。论文主要结论如下:1.BmNPV的orf61（Bm61）位于基因组61,188—61,892 nt,全长399bp,编码一个含133个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为15.5 kDa,Bm61是AcMNPV orf75的同源序列。在Bm61基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA。2.RT-PCR分析发现,Bm61在病毒感染宿主细胞12h开始转录,直到72h。利用大肠杆菌表达系统表达了BM61融合蛋白并制备了多克隆抗体。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm61的表达产物在病毒感染宿主细胞后12 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为15.5kDa,与预测的大小一致,说明Bm61是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。利用抗体检测发现BM61定位在细胞核膜和细胞核内周。3.利用phageλRed重组酶和Bac-to-Bac系统,在家蚕核型多角体病毒Bacmid中成功敲除Bm61基因。缺失Bm61的Bacmid转染细胞后,只有少量的细胞荧光,说明缺失Bm61导致病毒在细胞间的传染出现异常。PCR显示转染细胞的上清中没有BV产生,而Bm61的拯救病毒表现出和野生病毒相同的特性。证明Bm61是BV产生的必需基因。进一步分析Bm61缺失不影响病毒基因组复制和gp64的转录。4.orf74位于BmNPV基因组的69,987-70,449 nt之间,全长462 bp,编码154个氨基酸残基,预测分子量大约为17.3 kDa。在orf74基因ATG上游9nt处有一个杆状病毒晚期转录基序TTAAG。orf74是AcMNPVorf91的同源序列,5.orf74的转录分析表明,orf74从病毒感染后12h开始转录,一直持续到96h,可能是一个晚期表达基因。利用ORF74与GFP融合对其亚细胞定位进行了观察,发现ORF74的表达集中在细胞核。6.敲除orf74基因后构建了缺失orf74的病毒vBm-ko。vBm-ko在BmN上的复制结果表明:orf74的敲除不影响病毒在BmN细胞上增殖和基因组复制。幼虫分析表明orf74的敲除可以延长病毒杀死幼虫的时间,但是病毒的产量没有明显差异。这些结果表明orf74可能是病毒复制的非必须基因,可能与病毒的毒力有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 杆状病毒概述
• 1.1.1 杆状病毒的分类
• 1.1.2 杆状病毒的形态和结构
• 1.1.3 杆状病毒的生活周期
• 1.2 杆状病毒基因组研究进展
• 1.3 杆状病毒基因的研究进展
• 1.3.1 与病毒DNA复制的保守基因
• 1.3.2 与病毒基因转录相关的保守基因
• 1.3.3 结构基因
• 1.3.4 口服感染因子的研究
• 1.3.5 辅助基因的研究
• 1.3.6 抗细胞凋亡基因的研究
• 1.4 Red重组系统的研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 主要研究内容和研究路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 研究路线
• 第二章 Bm61的特性分析
• 2.1 基因序列与方法
• 2.1.1 序列来源
• 2.1.2 软件及使用方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 Bm61的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征
• 2.2.2 BM61的氨基酸同源性分析
• 2.3 讨论
• 第三章 Bm61的原核表达和多克隆抗体制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Bm61的克隆
• 3.2.2 Bm61基因的原核表达及检测
• 3.2.3 BM61蛋白的纯化
• 3.2.4 BM61蛋白的抗体制备与抗体的检测
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 Bm61在BmN细胞中的转录表达和蛋白的定位
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 Bm61的转录时相
• 4.2.2 Bm61的表达时相
• 4.2.4 BM61的亚细胞定位
• 4.2.5 BM61蛋白在病毒结构中的定位
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 家蚕核型多角体病毒Bm61的缺失和拯救
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 质粒、菌株、试剂和引物
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 大肠杆菌菌株BW25113-Bac的获得
• 5.2.2 Bm61基因打靶线性化片断的鉴定
• 5.2.3 重组质粒pUC-US-Cm-DS的酶切鉴定
• 5.2.4 Bm61缺失重组Bacmid的构建和验证
• 5.2.5 vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re三种Bacmid的获得
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 Bm61的功能分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 vBm61-ko、vBm-wt和vBm61-re在BmN细胞上的复制
• 6.2.2 vBm61-ko、vBm-wt或vBm61-re转染BmN细胞病毒增殖曲线分析
• 6.2.3 vBm61-ko和vBm-wt转染细胞后上清的PCR分析
• 6.2.4 Bm61缺失对病毒基因组复制的qPCR分析
• 6.2.5 Bm61的缺失不影响gp64基因的转录
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 orf74的功能解析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 orf74的核苷酸序列特征
• 7.2.2 orf74的氨基酸同源性分析
• 7.2.3 orf74的转录分析
• 7.2.4 orf74在BmN细胞中的定位分析
• 7.2.5 orf74的缺失和拯救的构建
• 7.2.6 orf74缺失病毒在BmN细胞中的复制
• 7.2.7 orf74缺失病毒的增殖曲线
• 7.2.8 orf74缺失对病毒基因组复制的影响
• 7.2.9 orf74缺失病毒感染BmN后的电镜分析
• 7.2.10 orf74缺失病毒的生物学分析
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 总结和展望
• 总结
• 展望
• 本研究创新点
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表的研究论文和参加的课题