新型抗EGFR抗体的设计及功能研究

论文摘要

EGFR即表皮生长因子受体,在多种人类肿瘤中存在过表达甚至高表达,尤其是在肝癌、卵巢癌等实体瘤中,其表达水平更高。EGFR的过度表达及其特异性配体EGF、TGF-α等的结合可导致EGFR的异常激活;活化的EGFR可进一步激活、调控多条信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、迁移,并通过介导VEGF表达促进肿瘤血管新生,进而在肿瘤的发生、发展、恶性程度及预后等过程中发挥重要作用。因此,通过阻断EGFR介导的信号转导通路以实现治疗肿瘤的目的成为近年来肿瘤治疗的热点。目前,国外已有多种以EGFR为靶点的抗体药物上市并在肿瘤临床治疗中表现出良好的治疗效果,但我国尚没有自主知识产权的抗体上市。因此,研制具有完全自主知识产权的新型抗EGFR功能抗体具有重要的理论和实际意义。本论文借助本实验室建立的“基于抗原-抗体相互作用的空间结构信息设计新型功能分子”的技术平台,根据上市抗体Erbitux特异性识别EGFR胞外区功能性抗原表位的结构特点,通过计算机辅助分子模拟技术设计获得了新型抗体MIL10,经真核表达、纯化及鉴定后,对抗体的功能活性及作用机制行了初步探讨。具体研究方法及结果如下:1、用于抗EGFR抗体筛选的肿瘤细胞系鉴定EGFR在多种肿瘤细胞表达异常,以上市抗EGFR功能性抗体Erbitux为阳性抗体,对实验室保存的多种肿瘤细胞进行筛选。流式细胞分析及Western blot等实验结果显示,卵巢癌细胞系SKOV3、肝癌细胞系HepG2、乳腺癌细胞系MCF7等细胞表面均有不同的程度的EGFR异常表达。进一步对EGFR激活的细胞内信号分子活化程度检测结果提示,卵巢癌细胞系SKOV3及肝癌细胞系HepG2中,AKT、EGFR等信号分子呈高水平磷酸化,并且这些分子的异常活化可以被功能性抗体Erbitux逆转。同时,在这两种细胞中,配体EGF可特异性激活EGFR信号,并且这种特异性的EGFR活化可以被抗体Erbitux抑制。提示,卵巢癌细胞系SKOV3及肝癌细胞系HepG2可以用于新型抗EGFR抗体的筛选鉴定。2、新型抗EGFR功能抗体MIL10的设计、合成及鉴定根据Erbitux与EGFR相互作用复合物的晶体结构,在合适的分子力场下,经力学优化、动力学模拟获得Erbitux与EGFR相互作用的理论构象。通过距离几何学、计算机图形学技术合理判定EGFR功能性抗原表位。借助本室建立的“基于抗原-抗体相互作用的空间结构信息设计新型功能分子”的技术平台,根据Erbitux特异性识别EGFR胞外区功能性抗原表位的结构特点,通过计算机辅助分子模拟技术合理设计新型抗体MIL10。理论分析显示,该抗体识别EGFR的表位与Erbitux基本一致,推测具有与Erbitux相似的生物学功能。根据计算机辅助分子设计的结果,通过基因全合成的方法获得了MIL10抗体可变区基因,将其构建到含IgG1亚型抗体恒定区基因的表达载体中,在真核细胞中获得表达。经纯化获得的抗EGFR抗体分子量为155kDa;可以特异性地被羊抗人IgG识别。进一步的实验结果显示,MIL10可以特异性识别高表达EGFR的细胞系SKOV3及HepG2,其结合活性与Erbitux相似;并且可以竞争性抑制Erbitux与靶细胞的结合,表明MIL10与Erbitux识别相同的抗原表位。3、MIL10的功能活性及其对细胞内信号的影响在获得具有识别活性的抗EGFR抗体MIL10的基础上,我们进一步评价了MIL10的生物学活性。抗体MIL10在体外具有与上市抗体Erbitux相似的功能活性:MIL10可以通过介导ADCC效应特异性杀伤靶细胞,进一步细胞划痕实验以及Transwell迁移实验等实验结果提示,MIL10可以明显抑制高表达EGFR的SKOV3及HepG2细胞的迁移能力;同时能显著降低细胞中VEGF及IGF-1等与肿瘤相关的细胞因子的表达水平。在上述功能研究的基础上,对MIL10发挥抑瘤效应的信号机制进行了初步探讨。MIL10可显著降低EGFR的活化水平,并且抑制下游通路中关键信号分子的活化,如PI3K/AKT信号通路中AKT的活化、MAPK/Erk信号通路中Erk的活化以及Src/STAT信号通路中STAT5的活化。提示,MIL10可以通过抑制EGFR信号通路的活化,发挥抗肿瘤作用。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 用于抗 EGFR 抗体筛选的肿瘤细胞系鉴定
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第二章 新型抗 EGFR 抗体 MIL10 的设计、合成及鉴定
• 第一节 新型抗 EGFR 功能抗体 MIL10 的合理设计
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二节 新型抗 EGFR 功能抗体 MIL10 的合成及鉴定
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 小结
• 第三章 MIL10 的功能活性及其对细胞信号的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢