论文摘要
单克隆抗体已显示出它很大的应用价值和发展前景,但目前发展起来的各类单克隆抗体包括嵌合抗体、人源化改形抗体、单链小抗体等都无法完全避免由于其存在鼠源性特征而导致的临床应用局限。 将未发生重排的人胚系免疫球蛋白轻、重链基因构建入YAC,再利用转基因技术转入内源免疫球蛋白基因缺陷的小鼠,使之产生高亲和力、强特异性、无免疫原性的完全人源化的人抗体,对抗体机制的深入研究和应用抗体进行人类疾病治疗具有非常重要的意义。 具有同源重叠区的酵母人工染色体（YAC）可以利用酵母细胞减数分裂进行同源重组,从而构建更大的人工染色体基因组,这对生命科学基础研究和生物技术应用研究有着非常重要的意义。本课题拟通过YAC技术,构建人胚系免疫球蛋白κ轻链全长基因并建立一系列的染色体大片段操作技术平台。 本工作首先利用酵母高效同源重组的方法,用与YAC右臂上具有同源序列的pRNA4质粒来转化YAC宿主酵母,成功地将目的YAC的右臂修饰上ADE2基因,并将原有的URA3基因敲除掉,经过ADE2基因的修饰,宿主酵母菌落由红色变成白色。通过ADE2基因和URA3基因的转换,在酵母减数分裂过程中可以通过营养筛选进行初筛。获得了修饰有营养基因ADE2的YAC。 在对实验室已有的覆盖人的免疫球蛋白轻链的几个YAC进行分析的基础上,本工作选择了与已经制备的修饰了营养基因ADE2的YAC具有同源重叠区的另一个YAC进行酵母减数分裂同源重组,通过酵母异型接合、二倍体发孢、单孢子筛选和PCR及Southem blot等鉴定技术和方法,构建了一条长约190kb,包含人的免疫球蛋白κ轻链恒定区外显子和增强子、5个J区和4个V区（L13-B3）的YAC重组体。验证了实验室建立的溶壁酶消化法获取单孢子重组体以及利用酵母人工染色体减数分裂同源重组的技术拼接大片断人工染色体的可行性。 在对实验室制备的单孢子重组体进行特有基因的Southern blot鉴定的基础上,本研究进一步用SalI和XbaI对单孢子重组体进行了酶切,并利用了YAC左、右臂探针及L13、Ck探针对酶切过的片段进行了Southern blot鉴定。结果发现,所制备的大小正确的重组体所在的宿主细胞有重复的YAC左臂或者右臂、YAC原有插入序列中J区和V区基因不完整。提示酵母减数分裂同源重组结果与我们预想得并不一致,酵母减数分裂同源重组过程是比我们所预想的要复杂。
论文目录
相关论文文献
- [1].同源重组修复基因在卵巢癌中的研究进展[J]. 国际妇产科学杂志 2019(04)
- [2].异位同源重组是新基因形成的一个重要机制[J]. 科学观察 2008(02)
- [3].通过胚胎干细胞基因同源重组构建p53基因缺失大鼠[J]. 生理科学进展 2011(01)
- [4].基于CRISPR-Cas9系统的HSV-1基因治疗载体的快速构建[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2017(10)
- [5].同源重组修复相关Rad51在肿瘤中的研究进展[J]. 中外医学研究 2019(09)
- [6].新城疫病毒同源重组现象的解析[J]. 中国家禽 2013(09)
- [7].双交换同源重组法构建Thermus thermophilus基因无痕敲除突变体[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版) 2019(02)
- [8].DNA损伤的同源重组修复机制[J]. 西部医学 2013(10)
- [9].同源重组修复蛋白RAD54B在肿瘤中的研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志 2020(09)
- [10].Ku基因在微生物中的研究进展[J]. 生物技术进展 2011(01)
- [11].细菌内同源重组法构建靶向Survivin的腺病毒载体的研究[J]. 现代生物医学进展 2016(17)
- [12].科技[J]. 种业导刊 2015(01)
- [13].Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 化学与生物工程 2013(06)
- [14].NAP1家族组蛋白分子伴侣在植物体细胞同源重组中有重要功能[J]. 复旦学报(自然科学版) 2012(03)
- [15].Rad51在同源重组中作用及其与肿瘤关系的研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志 2010(04)
- [16].拟南芥组蛋白分子伴侣AtHIRA参与体细胞同源重组及盐胁迫响应[J]. 植物学报 2018(01)
- [17].Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用[J]. 生物技术通讯 2011(06)
- [18].低能离子诱导拟南芥基因组不稳定性的研究[J]. 原子核物理评论 2008(02)
- [19].DNA聚合酶θ抑制同源重组,促进肿瘤发生[J]. 中华肺部疾病杂志(电子版) 2015(01)
- [20].同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望[J]. 生命科学 2018(09)
- [21].Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用[J]. 中国畜牧兽医 2017(07)
- [22].Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症易感基因UNC13D参与同源重组修复[J]. 中国实验血液学杂志 2013(03)
- [23].溯源联会[J]. 生物学通报 2018(09)
- [24].依托泊苷影响HEK293细胞同源重组修复体系[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2018(06)
- [25].小鼠TSC21基因敲除打靶载体的构建和胚胎干细胞同源重组克隆的鉴定[J]. 郑州大学学报(医学版) 2018(04)
- [26].RNA为模板首次实现植物同源重组修复[J]. 农业科技与信息 2019(19)
- [27].同源重组修复通路相关基因在上皮性卵巢癌中的研究进展[J]. 重庆医学 2018(30)
- [28].利用PCR介导的同源重组制备V型ATP酶的亚基蛋白VPH1[J]. 江苏农业学报 2017(05)
- [29].同源重组修复通路基因遗传变异与结直肠癌易感性的关联研究[J]. 第三军医大学学报 2019(18)
- [30].小鼠LRP16基因打靶载体的构建和同源重组型胚胎干细胞筛选(英文)[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(12)
标签：人免疫球蛋白轻链论文; 酵母人工染色体论文; 减数分裂同源重组论文; 单孢子重组体论文; 酶切鉴定论文;