抗鼻咽癌中药筛选模型的建立与应用研究

论文摘要

目的鼻咽癌是常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人民群众的健康。本课题利用体外实验方法、血清药理学实验方法和体内裸鼠移植瘤实验方法,以人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TW03、C666-1为研究对象,通过细胞和分子生物学等多项实验技术,建立了一套经济、快速、高效的抗鼻咽癌中药筛选模型,并利用此模型筛选了肿节风、黄芪、薏苡仁、千斤藤、黑墨草等5种中草药单方和鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊和养阴清热解毒剂等3种中草药复方,为中草药资源开发利用和鼻咽癌防治提供了理论依据。研究内容（一）体外药物直接作用法在建立抗鼻咽癌中药筛选模型中的应用研究方法以人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TW03、C666-1为研究对象,通过MTT法检测细胞毒性,流式细胞仪检测细胞凋亡等实验技术,建立了体外抗鼻咽癌中药筛选模型,并利用此模型筛选了肿节风、黄芪、薏苡仁、千斤藤、黑墨草、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊和养阴清热解毒剂等8种中草药单方和复方。结果在MTT实验中,薏苡仁、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊三种药在5天的时间范围内,随着加药浓度的增加,抑制率呈增加趋势,呈现出良好的量-效和时-效关系,并且在48h的IC50均小于50mg/L,根据体外药物筛选的标准,薏苡仁、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊在体外是有效的抗鼻咽癌细胞生长的中药。而肿节风、黄芪、黑墨草、千斤藤、养阴清热解毒剂随着加药浓度的增高,对四株鼻咽癌细胞的生长均没有表现出抑制作用。因此认为,此5种中药在体外无抗鼻咽癌细胞生长的作用。在流式细胞仪测细胞凋亡的实验中,薏苡仁、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊对鼻咽癌细胞株有很强的促进细胞凋亡的作用,而黑墨草、千斤藤、黄芪、养阴清热解毒剂、肿节风对鼻咽癌细胞株没有明显的促进细胞凋亡的作用。这与体外MTT法筛选的结果是一致的。（二）血清药理学实验方法在建立抗鼻咽癌中药筛选模型中的应用研究方法通过血清药理学实验方法,以人鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TWO3、C666-1为研究对象,采用MTT法检测细胞毒性,流式细胞仪检测细胞周期等实验技术,建立了抗鼻咽癌中药筛选模型,并利用此模型筛选了肿节风、黄芪、薏苡仁、千斤藤、黑墨草、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊和养阴清热解毒剂等8种中草药单方和复方。结果在MTT实验中,肿节风、薏苡仁、复方天仙胶囊和鼻咽清毒颗粒含药血清在5天的时间范围内,随着加药浓度的增加,抑制率呈增加趋势,呈现出良好的量-效、时-效关系,并且在48h的抑制率均大于30%,根据抗肿瘤药物筛选的标准,肿节风、薏苡仁、复方天仙胶囊和鼻咽清毒颗粒是有效的抗鼻咽癌细胞生长的药物。而黄芪、黑墨草、千斤藤、养阴清热解毒剂含药血清随着加药浓度的增高,对四株鼻咽癌细胞的生长均没有表现出抑制作用。在流式细胞仪检测细胞周期的实验中,鼻咽清毒颗粒组、复方天仙胶囊组、薏苡仁组、肿节风组均可将细胞阻滞于G0/G1期,表现为与对照组相比G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,G2/M期细胞比例下降（P<0.05）;而黑墨草组、千斤藤组、黄芪组、养阴清热解毒剂组对四株鼻咽癌细胞周期的改变,与对照组比较不明显。结果提示,鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊、薏苡仁、肿节风四种中药可以使处于G2/M期的细胞比例减少,处于G0/G1期的细胞比例增加,从而使进行有丝分裂的细胞减少,进而抑制鼻咽癌细胞的生长。而黑墨草、千斤藤、黄芪、养阴清热解毒剂无此作用。（三）体内抗鼻咽癌中药筛选模型的建立与应用研究方法运用人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,结合瘤组织HE染色、透射电镜观察瘤组织超微结构改变、原位组织化学法（TUNEL法）检测肿瘤组织细胞凋亡、免疫组织化学法检测肿瘤组织内Bcl-2,Bax和VEGF的蛋白表达量以及PCR-ELISA法检测肿瘤组织内端粒酶活性的改变,建立起体内抗鼻咽癌中药筛选的初步模型,并从中筛选了肿节风、薏苡仁、黑墨草、鼻咽清毒颗粒、复方天仙胶囊等5种中草药单方和复方在体内对CNE1、CNE2人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制情况。结果通过人体肿瘤的异体裸鼠移植瘤模型,筛选出肿节风和复方天仙胶囊对人鼻咽癌移植瘤具有明显的抑瘤作用（P<0.01）;薏苡仁对鼻咽癌移植瘤也有一定的抑瘤作用（P<0.05）,但根据抗肿瘤药物筛选标准,认为无筛选意义;鼻咽清毒颗粒和黑墨草对鼻咽癌移植瘤无抑瘤作用。其中肿节风、复方天仙胶囊和薏苡仁组在HE染色病理切片中见不同程度的肿瘤细胞减少,炎细胞浸润,成纤维细胞包裹;在透射电镜观察中见多个凋亡细胞聚集,核仁浓缩或碎裂,并见到类圆形的凋亡小体;在原位组织化学法中可见凋亡细胞所占比例增加;在免疫组织化学法中可见下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达以促进细胞凋亡,以及下调VEGF蛋白表达以抑制癌细胞的转移;在PCR-ELISA法检测端粒酶活性实验中可见端粒酶活性下降。结论运用体外实验方法、血清药理学实验方法和体内裸鼠移植瘤实验方法,建立了一套经济、快速、高效的抗鼻咽癌中药筛选模型,并利用此模型成功筛选出肿节风和复方天仙胶囊两种抗鼻咽癌中药。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 体外药物直接作用法在建立抗鼻咽癌中药筛选模型中的应用研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 5. 参考文献
• 第二部分 血清药理实验法在建立抗鼻咽癌中药筛选模型中的应用研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 5. 参考文献
• 第三部分 体内抗鼻咽癌中药筛选模型的建立与应用研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 5. 参考文献
• 全文总结
• 综述一
• 综述二
• 附图
• 博士期间发表论文期录
• 致谢