重组血管生长抑制因子Kringle 5的分离纯化

论文摘要

血管生长抑制因子kringle 5是目前发现的抑制血管增生活性最强的溶酶原片段，可有效抑制内皮细胞的增殖和迁移。它具有高效、高细胞选择性以及短的氨基酸序列的特点，这使它具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值。本研究在构建融合型血管生长抑制因子kringle 5原核表达系统及工程菌发酵条件优化的研究基础上，开始rK5蛋白分离纯化工艺的探索研究。先后采用了中性盐沉淀法（包括氯化钠和硫酸铵的分级沉淀）、等电点沉淀法、柱色谱法等多种不同的分离纯化工艺，反复试验、逐步筛选，最后建立了两步柱色谱法分离纯化重组kringle 5的新工艺。两步柱色谱法分离纯化重组血管生长抑制因子kringle 5的工艺主要包括：Ni2+螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲合柱色谱和Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱。其中Ni2+螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲和色谱柱规格为20×1.0 cm i．d．，流动相A为20 mmol／LPBS+0.5 mol／LNaCl（pH 7.4）溶液，流动相B为20 mmol／LPBS+0.5 mol／LNaCl+0.5 mol／L咪唑（pH 7.4）溶液，采用等度+梯度的方式洗脱，洗脱流速为2.0 mL／min。Sepharose G-75凝胶排阻色谱柱规格为100×1.5 cm i．d．，流动相为10 mmol／L PBS+0.15 mol／L NaCl（pH 7.4）溶液，采用等度方式洗脱，洗脱流速为1.0 mL／min。研究发现采用此工艺后，经第一步亲和柱色谱分离得到的目的蛋白用变性聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）分析，其纯度约为80％，蛋白得率约为1.92％；再经第二步凝胶柱色谱分离后得到目的蛋白纯度约为96％，蛋白总得率约为0.63％。最后，采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法对得到的纯化产物进行生物活性分析，结果表明纯化产物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长抑制作用明显。研究结果表明，两步柱层析法分离纯化重组血管生长抑制因子kringle 5的工艺路线正确，技术可行，为重组kringle 5的大规模生产和临床应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• Ⅰ 文献综述
• 1 血管生长抑制因子KRINGLE 5概述
• 1.1 血管生长抑制因子Kringle 5的结构
• 1.2 Kringle 5抑制血管增生的分子机制
• 1.2.1 Kringle 5与内皮细胞的迁移、增殖和凋亡
• 1.2.2 Kringle 5与血管增生平衡
• 1.2.3 Kringle 5与炎症反应
• 1.3 Kringle 5对血管增生性疾病治疗的实验研究
• 1.4 基因重组kringle 5的研究
• 2 本研究的目的、意义
• 3 研究开发的方向和重点
• Ⅱ 实验部分
• 1 实验材料
• 1.1 菌种及质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 仪器设备
• 2 工程菌的发酵
• 3 纯化工艺研究
• 3.1 发酵液的处理
• 3.2 重组Kringle 5的纯化
• 3.2.1 盐析法
• 3.2.2 等电点沉淀
• 3.2.3 色谱分离法
• 4 分析与检测
• 4.1 菌体浓度的测定
• 4.2 变性聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳
• 4.2.1 试液的配置
• 4.2.2 电泳样品制备
• 4.2.3 SDS-PAGE电泳条件
• 4.3 蛋白质的含量分析
• 4.4 重组Kringle 5生物活性的测定
• Ⅲ 结果与讨论
• 1 工程菌发酵结果与讨论
• 2 纯化工艺结果与讨论
• 2.1 中性盐沉淀法纯化工艺结果与讨论
• 2.1.1 硫酸铵分级沉淀工艺结果与讨论
• 2.1.2 氯化钠分级沉淀工艺结果与讨论
• 2.2 等电点沉淀法纯化工艺结果与讨论
• 2.3 柱色谱纯化工艺结果与讨论
• 2+螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱色谱'>2.3.1 Ni²⁺螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱色谱
• 2.3.2 Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱
• 3 分析与检测实验结果与讨论
• 3.1 SDS-PAGE电泳分析
• 3.2 重组Kringle 5的含量分析
• 3.3 活性鉴定
• Ⅳ 结论
• 1 结论
• 2 存在的主要问题
• 参考文献
• 致谢