朱萁小菇漆酶发酵条件优化、酶学性质及脱色应用研究

论文摘要

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在工业废水处理、造纸、纺织业等具有广泛的应用。本文对朱萁小菇（Mycena purpureofusca）漆酶发酵条件、酶学性质及其在合成染料脱色的应用进行深入研究。具体实验结果如下：（1）高产漆酶菌株的筛选与发酵条件优化通过测定发酵液漆酶活性比较分析不同菌株产漆酶能力，结果表明朱萁小菇漆酶产率最高，同时菌丝产量低，适合作为漆酶液体发酵的出发菌株。采用Plackett–Burman（P-B）设计筛选了朱萁小菇产酶液体培养基的营养因素，得到显著影响漆酶产量的因素有蔗糖、MgSO4和CuSO4，利用Box-Behnken（B-B）响应面实验优化确定了最佳的液体发酵产漆酶培养基配方为蔗糖4.26g/L、酵母粉15g/L、MgSO44.83g/L、KH2PO42.7g/L、CuSO45.625mg/L、VB10.1g/L，在此培养条件下，24℃发酵8d漆酶产量为519.3U/L，较出发培养基提高1.87倍。（2）漆酶的分离纯化与酶学性质研究本实验对朱萁小菇胞外漆酶进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。SDS-PAGE实验结果表明该漆酶表观分子量为61.7kDa；漆酶最适反应pH为2.2，最适反应温度为50℃，在中性pH、温度10℃-20℃的环境下较稳定；动力学常数Km和Vmax分别为0.296mM和0.0645mM/min；浓度为0.05mM的Fe3+、Mn2+、Cu2+、Ag+、Ca2+、Ba2+、Zn2+2+对漆酶酶活均有激活作用；Ag+对该漆酶催化能力有明显的促进作用，0.05mM与0.5mM浓度下的Ag+分别提高漆酶酶活18.7%和130.5%；Fe2+对该漆酶酶活的抑制效果最为明显，在0.05mM和0.5mM浓度下抑制率都超过98%。（3）粗酶液的染料降解应用本实验使用朱萁小菇粗酶液对四种染料进行脱色实验，结果显示粗酶液对RBBR与溴百里香酚蓝的脱色效果显著；单因素实验结果表明粗酶液对RBBR染料的脱色效率在前1h内较高；最适的脱色反应温度为40℃、最佳的脱色体系pH为3.0；随着实验底物浓度的增大，脱色率下降；在染料浓度饱和的情况下，酶浓度的增加会促进脱色速度；采用B-B设计对脱色时间、酶浓度和染料浓度进行响应面优化，实验结果表明脱色时间和酶浓度对脱色率影响显著，最佳脱色条件为脱色时间2小时43分钟、酶浓度0.217U/mL、RBBR浓度142mg/L，在此条件下RBBR脱色率为97.03%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 漆酶的研究进展
• 1.1.1 漆酶的来源
• 1.1.2 漆酶的结构
• 1.2 漆酶的性质
• 1.2.1 温度对漆酶的影响
• 1.2.2 pH 值对漆酶的影响
• 1.2.3 金属离子对漆酶的影响
• 1.3 漆酶催化反应机理
• 1.3.1 无介体参与的漆酶催化反应
• 1.3.2 漆酶—介体系统
• 1.4 漆酶的底物
• 1.5 漆酶的发酵生产
• 1.5.1 液体发酵与固体发酵
• 1.5.2 碳源和氮源对漆酶发酵产量的影响
• 1.5.3 响应面法优化发酵条件
• 1.6 染料废水处理研究现状
• 1.6.1 染料废水的危害性
• 1.6.2 染料废水的传统处理方法
• 1.6.3 生物法降解染料的优势
• 1.7 实验材料背景
• 1.8 本研究的目的和意义
• 第二章 菌株筛选与发酵优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 培养条件
• 2.1.6 漆酶酶活的测定
• 2.1.7 菌株筛选
• 2.1.8 不同碳源对朱萁小菇产漆酶的影响
• 2.1.9 不同氮源对朱萁小菇产漆酶的影响
• 2.1.10 显著因素筛选与爬坡实验
• 2.1.11 Box-Behnken 设计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌株筛选
• 2.2.2 不同碳源对朱萁小菇产漆酶的影响
• 2.2.3 不同氮源对朱萁小菇产漆酶的影响
• 2.2.4 显著因素筛选与爬坡实验
• 2.2.5 Box-Behnken 设计
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 漆酶的分离纯化与酶学性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 粗酶液的制备
• 3.1.5 漆酶酶活的测定
• 3.1.6 丙酮分级沉淀
• 3.1.7 DEAE-sepharose 阴离子交换柱层析
• 3.1.8 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析
• 3.1.9 SDS-PAGE
• 3.1.10 漆酶动力学常数的测定
• 3.1.11 最适反应温度和热稳定性
• 3.1.12 最适反应 pH 和 pH 稳定性
• 3.1.13 金属离子对漆酶酶活的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 丙酮分级沉淀
• 3.2.2 DEAE-sepharose 阴离子交换柱层析
• 3.2.3 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶层析
• 3.2.4 SDS-PAGE
• 3.2.5 漆酶动力学常数的测定
• 3.2.6 最适反应温度和热稳定性
• 3.2.7 最适反应 pH 和 pH 稳定性
• 3.2.8 金属离子对漆酶酶活的影响
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 漆酶的染料降解
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与染料
• 4.1.2 粗酶液的制备
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 脱色体系与脱色率的计算
• 4.1.5 各染料浓度标准曲线
• 4.1.6 朱萁小菇漆酶对 4 种染料的脱色实验
• 4.1.7 反应时间对 RBBR 脱色的影响
• 4.1.8 反应温度对 RBBR 脱色的影响
• 4.1.9 体系 pH 对 RBBR 脱色的影响
• 4.1.10 底物浓度对脱色反应的影响
• 4.1.11 漆酶酶活对脱色反应的影响
• 4.1.12 响应面法优化脱色条件
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 朱萁小菇粗酶液对 4 种染料的脱色实验
• 4.2.2 反应时间对 RBBR 脱色的影响
• 4.2.3 反应温度对 RBBR 脱色的影响
• 4.2.4 体系 pH 对 RBBR 脱色的影响
• 4.2.5 底物浓度对脱色反应的影响
• 4.2.6 漆酶酶活对脱色反应的影响
• 4.2.7 响应面法优化脱色条件
• 4.3 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢