论文摘要
本文采集了我国29种珍稀濒危兰科药用植物种子,系统研究了11种兰科植物种子的无菌萌发特性,总结了无菌萌发规律。发现了8株兰科植物种子萌发真菌,为兰科药用植物种子在自然条件下萌发成苗奠定了理论和应用基础。主要研究结果如下:1、从花、果实、种子的角度验证了材料的准确性,利用显微观察和扫描电镜技术研究了兰科药用植物种子的形态特征,发现,附生兰石斛种子的种皮具有相似的表面结构,种皮细胞细长,连接处形成圆柱状隆起,隆起部位分布有电镜下较亮的点块物质,而地生兰白芨,云南独蒜兰的种子则不具备这些特征。2、对原球茎的发育过程进行了描述和分级,确定了原球茎发育过程的分级方法,对4种地生兰和7种附生兰无菌萌发营养需求进行了比较研究,确定了每一植物种子无菌萌发的最适合营养条件,发现N6培养基是石斛类种子较适合的培养基,天然附加物对种子萌发和原球茎发育有促进作用,地生兰植物对营养需求比较独特,不同种类之间有较大差异。比较了光照对铁皮石斛、鼓槌石斛、云南独蒜兰、白芨种子无菌萌发的影响和温度对云南独蒜兰种子无菌萌发的影响。发现,黑暗培养能够提高种子的萌发率,如铁皮石斛在黑暗条件下的萌发率为95.07%,显著高于光照条件下的萌发率88.91%。短期光照起动种子的萌发,加快种子的萌发速度,如铁皮石斛种子经过1周光照后暗培养,在播种后的第2周开始萌发,比直接暗培养的种子早2周萌发。光照是诱导原球茎发育和幼苗生根的环境条件,11种兰科植物播种后,在黑暗条件下培养2年也不生根,光照条件下3-5个月就可以生根。墨兰由于播种后2年都没于萌发,所以,没有确定墨兰种子合适的无菌萌发条件。根据以上结果,建立了11种兰科植物种子无菌萌发的最适条件。3、发现了一种新的兰科植物种质资源的保存方法,该方法的在不同植物种类上的成功率接近100%,保存两年后的恢复率达到98%以上。4、应用超低温保存白芨和云南独蒜兰种子后,种子的活力都超不过5%,该方法不适合于这两种植物种子的保存。5、建立了一套铁皮石斛的组培快繁体系,该体系不使用任何激素,与以往快繁体系相比,具有成本低廉,省工的特点,具有持续提供优质种苗的优点,适合工厂化大规模生产中应用。6、创建了一种促进兰科植物种子萌发的真菌的分离和筛选方法,利用该方法从白芨原球茎中分离获得了18株真菌,合并为15株,从云南独蒜兰的种子中分离纯化了49株真菌,合并为30株真菌。7、从55株真菌中,筛选得到了8株有效的促白芨种子萌发的真菌菌株,萌发特性研究发现:白芨种子接菌共生萌发明显优于无菌萌发,表现在:初始萌发时间早,萌发率高,萌发后原球茎的发育速度快。以胶膜菌属真菌（Tulasnella sp.）Bsg14促进白芨种子萌发来说,播种后2个月观测,萌发率为61.17%,共生萌发的白芨种子此时已经发育形成原球茎,再经过一个月的培养形成2—3片叶的幼苗,而不接种真菌的对照,在播种后4个月观测,萌发率仍然为0。利用分子生物学技术,8株真菌中的5株鉴定到了属,分别为:胶膜菌属（Tulasnella sp.）、丝核菌属（Rhizoctonia sp.）、疣孢漆斑菌属（Myrothecium sp.）、小菇属（Mycena sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）,3株无法鉴定到属。8、首次获得了促进铁皮石斛、束花石斛、黑毛石斛、兜唇石斛种子萌发的真菌菌株,菌株编号:Bsg14,为胶膜菌属真菌。该结果是通过使用6株促白芨种子萌发活性较高的真菌菌株与22种兰科植物种子大规模筛选获得的。9、应用两种共生萌发体系对胶膜菌属（Tulasnella sp.）真菌促进铁皮石斛、束花石斛、黑毛石斛、兜唇石斛种子萌发的特性进行了研究,结果表明,该株真菌促昕进这4种植物种子萌发的活性很高,具有萌发速度快,萌发率高,原球茎发育速度快的优点,比如:铁皮石斛种子接种真菌后,从播种的第3周种子开始萌发,第7周时萌发率达到了79.34%,第8周原球茎即生长出了叶片,而不接种真菌的对照,在播种后3个月时观测,萌发率仍然为0。10、阐明了光照条件对兰科种子接菌共生萌发的影响。其结果为:光照能够调节兰科植物种子接菌共生萌发的萌发率及原球茎发育。对石斛来说,光照对最终萌发率没有明显影响,显著促进原球茎的发育,共生萌发的原球茎只有在光照的诱导下才能发育成幼苗。对白芨来说,短期光照和长期光照都能够显著的提高共生萌发的萌发率和原球茎发育速度。11、明确了兰科植物种子共生萌发后原球茎长宽增长的特性。铁皮石斛种子接菌共生萌发的原球茎大小增长模型为:y=—1251.46+266.53×1nx,判定系数为0.952;白芨种子室内接菌共生萌发的原球茎大小增长模型为:y=728.06—196596.6/x,判定系数为0.937;白芨种子自然界萌发的原球茎大小增长模型为:y=—636.753+156.250×1nx,判定系数为0.883,以上结论表明,原球茎的长宽比具有可预测性。12、使用环境扫描电镜对5种兰科植物种子接菌共生萌发原球茎的表征超微结构研究,发现了兰科植物种子共生萌发的形态特性:（1）共生萌发真菌对种子的侵入部位有选择性,或者说,兰科植物种子或原球茎提供了真菌入侵的部位,其侵入位点是:吸水孔,表皮毛。（2）共生萌发导致气孔特化关闭,共生萌发真菌侵入原球茎后,原球茎的气孔结构产生质的变化,形成无开合机制的闭合结构。