PD-1/PD-L信号参与慢性乙肝病毒感染特异性CTL功能衰竭的研究

论文摘要

乙型肝炎是严重的肝脏感染性疾病。目前全世界慢性HBV感染者已经超过4亿,乙肝相关肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加,严重威胁着人类健康。由于目前HBV感染后慢性化的确切机制尚不清楚,所以无法制定出行之有效的治疗方法和方案。HBV作为嗜肝性DNA病毒,本身对肝细胞并没有损害,在清除病毒和造成肝细胞损伤中起关键作用的是CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte ,CTL）。急性乙肝病毒感染可激发强烈的多表位特异性CTL应答;但慢性感染时,特异性CTL增殖、细胞因子分泌及细胞毒效应功能均发生不同程度损伤,与HBV感染持续不能清除直接相关,其原因仍待研究。T细胞的分化、活化及发挥效应功能除了需要来自TCR的第一信号,还需要来自共刺激分子的辅助调节信号。PD-1是CD28家族的共刺激分子,与配体PD-L结合后可阻断TCR信号的传递。众多研究表明,PD-1/PD-L共刺激信号通路在T细胞活化、增殖和细胞因子分泌等各个过程中均发挥重要的负性调节作用。2006年,Barber小组的研究工作发现,在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠体内,功能衰竭的T细胞表达PD-1上调,阻断PD-1与其配体之间的相互作用能使衰竭的T细胞恢复活力并显著降低病毒载量。此后,在HIV,HCV等慢性病毒感染性中也相继发现PD-1/PD-L1通路与病毒特异性CD8+T细胞功能障碍有关,该通路在慢性HBV感染中的研究也已初见报道。但是, PD-1/PD-L通路对HBV特异性CTL分化、活化过程的影响目前仍不清楚,而特异性CTL的分化和活化是其发挥效应功能的基础。另一方面,PD-1/PD-L通路在HBV的感染的靶器官——肝脏中的表达及其与疾病发展的关系仍未见报道。因此,为更全面地认识PD-1/PD-L共刺激信号通路在乙型肝肝炎病毒慢性感染中对特异性CTL功能的调节作用,我们开展了以下研究:首先,利用多色流式细胞仪结合pentamer技术检测了PD-1分子在HBV特异性CTL的表达情况。结果显示,慢性乙肝患者HBV特异性CTL表达PD-1百分率显著增高,显著高于作为对照的CMV特异性CTL及外周血总CD8+T细胞。而分析PD-1的表达水平与患者血浆病毒载量及性别、年龄和ALT水平之间关系显示, PD-1的表达水平与血浆中HBV病毒的载量正相关,与其他指标无显著相关性。以上结果提示,可能是患者体内高载荷的HBV病毒引起了PD-1表达的上调。那么PD-1表达的上调对特异性CTL的分化、活化及多种抗病毒效应功能是否发生影响呢?结合表面分化抗原CD27、CD45RA和趋化因子受体CCR7的表达,我们观察了在T细胞不同分化阶段PD-1表达的变化,我们发现在CTL细胞分化的不同阶段,PD-1表达存在显著差异。CCR7+ CD27+CD45RA+初始CD8+T细胞PD-1表达极少,在遭遇抗原后（CD45RA-） PD-1表达上调。在分化中期CCR7-CD27+CD45RA-T细胞上PD-1表达达到最高。而分化至终末阶段的CCR7-CD27-CD45RA+T细胞中,PD-1表达又复下调。PD-1表达与CTL分化之间存在明显关联。而慢性乙肝感染患者特异性CTL多集中于分化中后阶段,高表达PD-1分子;但作为对照的CMV特异性CTL大多高分化,PD-1表达水平较低的。因此,分化与PD-1表达的差异使HBV特异性CTL可能接收更强的抑制信号。通过表面活化标志检测,我们发现慢性乙肝患者体内PD-1+ CTL高表达活化标志CD38和HLA-DR。接着利用胞内因子染色法检测抗病毒效应分子的表达,我们发现PD-1+特异性CTL胞内仍有较高的GrB的表达,但perforin表达低下、IFN-γ表达极低。以上表型提示慢性乙肝患者PD-1+特异性CTL虽然高度活化,但实际处于功能受损状态。PD-1/PD-L通路的抑制效应不仅取决于PD-1的表达量,还取决于PD-1与其配体配接的程度,因此慢性HBV感染时PD-L的表达量也至关重要。于是我们检测了外周血淋巴和单核细胞中PD-1配体PD- L1和PD-L2的表达。结果显示,慢性乙肝患者外周血单核细胞表面PD-L1表达显著上调,而T和B淋巴细胞群体表面PD-L1的表达无显著变化,同时PD-L2在单核和淋巴细胞中的表达也没有显著变化。结合患者临床信息分析发现,外周血单核细胞PD-L1的表达量与血浆ALT水平显著正相关。这可能提示,在肝脏炎症增加的同时机体也开始上调免疫抑制因子以控制炎症损伤程度。慢性乙肝感染时单核细胞上调PD-L1表达是否抑制特异性T细胞的应答?阻断PD-1/PD-L1通路又是否能够恢复特异性T细胞的功能?为回答上述问题,我们进行了PD-1/PD-L1通路阻断实验:分离慢性乙肝感染患者外周血PBMC进行体外培养,其中加入特异性表位肽刺激特异性CTL发生活化和增殖,在以上体系中利用PD-L1的阻断性抗体阻断PD-1/PD-L通路后观察特异性CTL增殖和效应功能的变化。结果显示,加入阻断性抗体以后,特异性CTL的增殖能力显著增强,清除病毒的重要效应因子IFN-γ的分泌能力显著提高。上述结果提示,在慢性HBV感染患者外周血中,PD-1/PD-L1通路参与特异性CTL的功能障碍的调节,阻断该通路能使功能受损的特异性CTL的增殖和细胞因子分泌效应功能恢复。肝脏是HBV特异性感染的靶器官,且有研究表明PD-1/PD-L1通路参与肝内T细胞免疫耐受的调节。因此,为阐述PD-1/PD-L这一重要的免疫调节通路在慢性乙肝感染肝脏的表达及其在疾病进程中的可能作用,我们进行了以下研究:首先,利用免疫组织化学方法检测了PD-1在慢性乙肝感染患者肝活检组织中的表达情况。结果显示,慢性乙肝感染肝组织中PD-1阳性细胞显著增加,且PD-1分子主要表达在汇管区和肝小叶中浸润单个核细胞上。免疫双荧光染色实验提示,PD-1表达在CD4+和CD8+T淋巴细胞以及少量CD20+B淋巴细胞上。这提示,在慢性乙肝感染肝脏中浸润着大量活化的淋巴细胞,它们表达PD-1分子上调。接着我们检测了PD-1的两个配体在慢性乙肝感染肝脏中的表达。结果显示,PD-L1的表达在HBV慢性感染肝脏中显著上调,除了浸润炎症细胞以外,Kupffer’s细胞、血窦内皮细胞及DC细胞等大量肝脏原位抗原递呈细胞均上调PD-L1的表达。而另一个配体PD-L2的表达则没有显著变化。比较炎症损伤程度不同及炎症细胞浸润程度不同的肝组织中原位抗原递呈细胞上PD-L1的表达,我们发现PD-L1的表达与肝组织炎症损伤和炎症细胞浸润程度均密切相关。上述结果提示,肝组织的炎症损伤和免疫应答上调了肝脏原位抗原递呈细胞表面PD-L1的表达,这可能起到控制免疫反应强度,保护肝组织的作用。因此,PD-1/PD-L1抑制性通路在慢性乙肝感染肝脏中上调可能起着双重作用:一方面保护肝组织免受免疫病理损伤,另一方面也导致特异性免疫应答下调、病毒持续不能清除。本研究发现,慢性乙肝感染患者外周血及肝组织中抑制性共刺激分子PD-1/PD-L1通路均上调,阻断该通路能缓解特异性CTL的功能低下状态。这对于认识HBV感染的慢性化机制有着重要意义,PD-1/PD-L1通路的精确调控可能为慢性乙型肝炎的治疗提供新的线索和思路。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 PD-1/PD-L信号参与慢性乙肝病毒感染特异性CTL 功能衰竭的研究
• 前言
• 第一部分 慢性乙肝患者HBV 特异性CTL 及单核细胞上调PD-1 及其配体PD-L1 表达并介导特异性CTL 功能障碍
• 第一节 慢性乙肝患者特异性CTL 上调PD-1 表达
• 材料与方法
• 结果
• 第二节 PD-1 表达对特异性CTL 活化、分化及抗病毒效应功能的影响
• 材料与方法
• 结果
• 第三节 PD-L 在慢性乙肝患者外周血单核细胞表达上调
• 材料与方法
• 结果
• 第四节 PD-1/PD-L1 通路对HBV 特异性CTL 增殖和细胞因子分泌的调节
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 慢性 HBV 感染时肝脏原位抗原递呈细胞 PD-L1 表达上调
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 PD-1及其配体在感染和自身免疫性T 细胞应答中的调节作用
• 参考文献
• 文献综述二 肝脏的免疫活化与耐受
• 参考文献
• 博士期间发表和拟发表的文章
• 英文论著