旋覆花素抑制球囊损伤诱导的新生内膜形成的机制研究

论文摘要

目的:经皮腔内冠状动脉成形术（percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA）是目前治疗冠心病的安全、有效方法之一。但其远期效果受到局部血管再狭窄（restenosis, RS）的影响。旋覆花素（1-o-acetylbritannilactone, ABL）作为一种具有消炎、镇痛、活血化瘀功效的天然有效成份,以往体外实验结果表明, ABL对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的单核/巨噬细胞活化和环加氧酶-2 （cyclo-oxygenase-2, COX-2）基因的表达具有显著抑制作用。本实验在前期研究的基础上,通过复制大鼠胸腹主动脉球囊损伤模型,探讨ABL抑制球囊损伤大鼠内皮增生的机制,为该药的研发提供实验基础。方法:1球囊损伤动物模型的复制及分组将动物常规麻醉消毒,沿颈部正中线切口,于气管左侧分离左侧颈总动脉,在颈总动脉剪一楔形切口,球囊导管自切口插入至胸腹主动脉远心端,充盈球囊后将其拖回到胸主动脉起始部,如此反复三次;球囊减压后退出,关闭切口。实验动物分为三组,分别为正常组、球囊损伤组和ABL组。2标本的处理于术后不同时间从股动脉放血处死大鼠,分离胸腹主动脉,分别提取胸腹主动脉总蛋白、核蛋白及RNA。分离胸腹主动脉中段血管用与病理切片,HE染色观察ABL对血管内膜增生的抑制作用;通过电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）观察ABL对球囊损伤诱导的核因子κB （NF-κB） p65与DNA顺式元件相互作用的影响;Western blot分析检测NF-κB p65的表达及其核转位以及炎性基因COX-2和iNOS的表达变化;RT-PCR检测炎性基因ICAM-1转录情况的影响;结果:1 ABL抑制球囊损伤后血管内膜的增生球囊损伤术后14天,ABL组血管内膜的增生程度明显小于球囊损伤组,两组的血管内膜/中膜（intima/media, I/M）厚度比分别为0.45±0.03和1.87±0.16,两组之间比较具有显著性差异（P < 0.01）。表明ABL可以明显抑制球囊损伤后血管内膜的增生。2 ABL抑制球囊损伤诱导的NF-κB p65的表达及核转位Western blot结果显示:在正常血管中NF-κB p65少量表达。球囊损伤后,血管总蛋白中p65的水平呈进行性升高,于术后14天含量达到峰值。ABL可抑制球囊损伤诱导的NF-κB p65表达。而且,ABL对p65从胞浆至胞核的转位过程也具有明显的抑制作用。3 ABL抑制球囊损伤后血管中IκB的磷酸化降解Western blot分析结果显示,正常血管细胞的胞浆中含有较高水平的IκB-α。球囊损伤14天时,IκB-α水平明显降低,约为正常组的46.7%,而磷酸化的IκB-α则较正常组升高。ABL对IκB的磷酸化具有较强的抑制作用,使磷酸化的IκB-α水平较球囊损伤组降低了89.2%±7.4%,具有显著性差异（P<0.01）。提示ABL具有抑制IκB磷酸化降解提高其稳定性的作用。4 ABL抑制球囊损伤后NF-κB p65与DNA顺式元件的相互作用以5’末端标记的含有NF-κB结合基序的双股寡核苷酸为探针,分别与三组血管组织核蛋白进行结合反应。经电泳分离后,放射自显影可见,球囊损伤组的核蛋白与探针的结合活性显著增加,在5% PAGE上出现滞后的DNA-蛋白质复合物区带,ABL则对NF-κB与DNA的结合活性有明显的抑制作用。5 ABL抑制球囊损伤的炎性基因COX-2、iNOS和ICAM-1的表达Western blot分析检测了NF-κB下游炎性基因COX-2和iNOS的表达变化情况。结果显示:球囊损伤14天时,血管组织中COX-2和iNOS蛋白水平较正常组显著升高;给予ABL后,两种蛋白的水平明显降低,与球囊损伤组相比分别降低了65.7%±7.9%和47.2%±5.4%,具有显著性差异（P<0.01,P<0.01）。RT-PCR结果显示:球囊损伤3天后血管组织中ICAM-1 mRNA表达活性显著增高,ABL组对ICAM-1 mRNA的表达具有明显抑制作用,与球囊损伤组相比降低了56.3%±7.3%,两组比较差异有统计学意义（ P < 0. 01）。6 ABL对COX-2催化活性的影响为了观察球囊损伤以及ABL对COX-2活性的影响,用酶联免疫法检测实验检测PGE2水平。结果显示,正常组、球囊损伤组、ABL组血清的PGE2含量分别为:1300±129 pg/ml,2600±195 pg/ml和945±136 pg/ml。与球囊损伤组相比,ABL组能够明显抑制PGE2的合成（P < 0.01）。7 ABL抑制球囊损伤后血管组织中IKKβ的磷酸化降解进一步研究表明,球囊损伤后14天时,血管组织中IKKβ和p-IKKβ的表达均有所升高,ABL则对血管组织中IKKβ和p-IKKβ水平具有明显的抑制作用,分别较球囊损伤组降低了46.9%±6.7%和88.1%±9.2%,具有显著性差异（P<0.01,P<0.01）。结论:1 ABL通过抑制IKKβ表达和磷酸化活化,进而减少IκB的磷酸化降解,抑制球囊损伤后NF-κB p65的核转位及与DNA的结合活性,从而减轻炎症反应,抑制血管新生内膜的形成。2 ABL能够抑制球囊损伤诱导的炎性基因COX-2、iNOS和ICAM-1的表达和血清中PGE2的合成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 旋覆花素抑制球囊损伤诱导的新生内膜形成的机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Livin 与肿瘤关系的研究进展
• 致谢
• 个人简历