柿果实扩张蛋白基因cDNA克隆及原核表达

论文摘要

扩张蛋白（expansin,EXP）能使植物细胞壁松驰,在果实成熟软化过程中起重要作用。克隆柿果实扩张蛋白基因,对研究柿果实成熟软化机理,进而有效控制柿果实成熟软化进程,延长保鲜期具有重要意义。本研究以中国柿（Diospyros Kaki L.cv Fuping jianshi）为试材,在果实不同发育时期分别提取总RNA,进行RT-PCR结合RACE技术扩增得到五个扩张蛋白基因cDNA全长序列,并构建了原核表达载体。取得的主要结果如下:1.柿果实扩张蛋白基因的cDNA克隆以柿果实不同发育时期提取的总RNA为模板,利用RT-PCR结合RACE技术扩增得到五个扩张蛋白基因:成熟期CDK-Exp3（1168bp）,转色期CDK-Exp4（1120bp）和CDK-Exp5（1018bp）,膨大期CDK-Exp6（1129bp）和CDK-Exp7（1121bp）;其中CDK-Exp3是包含完整5’和3’末端的全长cDNA序列,CDK-Exp4、CDK-Exp5、CDK-Exp6和CDK-Exp7是包含完整ORF和3’末端的cDNA序列。2.柿果实扩张蛋白基因的生物信息学分析柿果实扩张蛋白基因的编码区ORF为765bp,编码254个氨基酸残基,具有扩张蛋白的保守序列（如HFD基元）和不变残基,即N端有8个半胱氨酸残基,C端有4个色氨酸残基;预测分子量27150.36 D,等电点7.587。CDK-Exp3编码的蛋白前27个氨基酸是典型的信号肽结构。由柿果实CDK-Exp3推导的氨基酸序列与CDK- Exp4、CDK- Exp5、CDK- Exp6、CDK- Exp7的同源性分别为99.2%、99.2%、98.4%、98.8%,与CDK- Exp1、CDK- Exp2的同源性在80%左右;与杏、樱桃、梨、苹果的同源性在80%以上,与桃、李、草莓、黄瓜的同源性在70%以上,与番茄的同源性为65.7%;同在转色期克隆到的CDK- Exp4与CDK- Exp5的氨基酸序列同源性为100%,但二者的核苷酸序列在3’端非编码区相差102bp。3.柿果实扩张蛋白基因的原核表达设计带有酶切位点的引物,扩增出去掉信号肽结构的CDK-Exp3的ORF序列,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,定向克隆到表达载体pET-32（a+）中,获得柿果实扩张蛋白基因原核表达载体pET- CDK-Exp3。将构建的表达载体pET-CDK-Exp3转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达得到大小约为44kDa的蛋白;诱导表达的最佳条件为:0.1mM IPTG,37℃诱导表达6h。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物细胞壁扩张蛋白（ Expansin）研究进展
• 1.1.1 植物 Expansin 的发现
• 1.1.2 Expansin 与细胞生长
• 1.1.3 Expansin 与果实成熟软化
• 1.1.4 Expansin 引起的细胞壁松弛特性及作用模式
• 1.1.5 Expansin 的序列分析
• 1.1.6 Expansin 研究展望
• 1.2 果实采后生物技术的应用
• 1.2.1 PG 与果实延熟
• 1.2.2 ACC 合成酶与果实延熟
• 1.2.3 ACC 氧化酶与果实延熟
• 1.3 RACE 技术
• 1.3.1 克隆全长cDNA 的方法
• 1.3.2 RACE 技术的原理和优缺点
• 1.3.3 RACE 技术的应用及前景
• 1.4 基因体外原核表达技术
• 1.4.1 细菌表达系统的应用范围
• 1.4.2 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件
• 1.4.3 原核表达系统中几中常见的载体系统
• 1.4.4 宿主菌的选择
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 果实材料
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 柿果实总 RNA 提取与检测
• 2.2.2 反转录及RT-PCR 扩增EXP 基因片段
• 2.2.3 PCR 产物回收纯化
• 2.2.4 cDNA 克隆
• 2.2.5 3’RACE 和5’RACE 反应
• 2.2.6 EXP 基因全长序列的获得及分析
• 2.2.7 原核表达载体构建
• 2.2.8 融合蛋白诱导表达
• 第三章 结果分析
• 3.1 柿果实总 RNA 的提取
• 3.2 RT-PCR 扩增柿果实EXP 基因片段
• 3.3 5’RACE 和3’RACE 扩增结果
• 3.4 柿果实EXP 基因cDNA 全长扩增
• 3.5 序列分析
• 3.5.1 核苷酸序列比对分析
• 3.5.2 柿果实扩张蛋白基因推导的氨基酸序列分析
• 3.5.3 柿果实扩张蛋白基因氨基酸序列系统进化分析
• 3.5.4 信号肽预测结果
• 3.6 原核表达
• 第四章 讨论
• 4.1 柿果实基因cDNA 克隆
• 4.2 CDK-Exp3 的原核表达
• 4.2.1 设计扩增ORF 的引物
• 4.2.2 表达系统及表达条件的选择
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略语
• 致谢
• 作者简介