多倍体水稻胚乳发育中几个淀粉合成相关酶及其基因的初步研究

论文摘要

水稻是世界人口的主食来源之一。随着世界人口的不断增加以及人们对生活品质的要求越来越高,目前的水稻产量及品质不能满足现状。因此,水稻育种研究者的任务艰巨,尽早研究出高产、优质水稻。本实验室利用远缘杂交和多倍体化双重优势,经过多年实验选育出2个具有减数分裂稳定性（Polyploid Meiosis Stability, PMeS）的多倍体水稻品系（HN2026-4X和SG99012-4X）中的HN2026-4X,它减数分裂基本正常,具有较高结实率,与其它多倍体水稻的杂交后代也具有高结实率,尤其是它的后代直链淀粉含量降低、支链淀粉含量升高。稻米蒸煮食用品质的优劣由直链淀粉和支链淀粉在胚乳中的组成决定,合适的直链淀粉含量是优质稻米的重要指标。因此,对该多倍体水稻胚乳中淀粉合成中关键酶的酶活及相关基因的表达分析意义重大。本研究首先采用双波长法分别对日本晴-2X、HN2026-2X、HN2026-4X、巴利拉-2X和巴利拉-4X这5个水稻品系进行稻米直链淀粉和支链淀粉含量测定。其中直链淀粉含量测定的主波长用620nm,参比波长用430nm,支链淀粉含量测定的主波长用540nm,参比波长用720nnm。然后,针对这5个水稻品系花后6天、9天、12天、15天、18天、21天的6个时期水稻胚乳,选取水稻淀粉代谢中的ADPG焦磷酸化酶（ADPglucose pyrophosphorylase）、颗粒淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase）和可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase）这3个关键酶,分别进行这3个酶的酶活变化分析。最后,结合日本晴品种中的淀粉合成相关酶基因的克隆和功能分析结果,针对这5个水稻品系花后0天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天的8个时期水稻胚乳,选取6个淀粉合成相关酶基因OsAGPS2b、OsSSⅠ、OsSSⅡa、OsGBSSⅠ、OsBEⅠ、OsBEⅡb,进行RT-PCR。结果发现：HN2026-4X的直链淀粉含量低、支链淀粉高。在水稻灌浆早期,HN2026-4X的AGPase活性较高；中后期,其活性较低。在水稻灌浆中后期,HN2026-4X的GBSS活性低于其他四个品系。HN2026-4X的SSS活性大多低于巴利拉-2X,高于其他三个品系。HN2026-4X的OsAGPS2b基因、OsSSⅠ基因和OsBEⅡb基因处于中上表达水平；其OsGBSSI基因、OsSSⅡa基因处于中下表达水平。HN2026-4X的OsGBSSI基因发生变化,有一大一小两个编码框组成,其中1584bp编码的多肽比正常的GBSS少82个氨基酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一部分 综述
• 1.1 多倍体水稻的研究进展
• 1.2 水稻胚乳中淀粉合成过程
• 1.3 淀粉合成相关酶的研究进展
• 1.3.1 ADP葡萄糖焦磷酸化酶
• 1.3.2 淀粉合成酶
• 1.3.3 淀粉分支酶
• 1.3.4 淀粉去分支酶
• 1.4 基因表达检测方法
• 1.4.1 Northern印迹及相关技术
• 1.4.2 核糖核酸酶保护实验
• 1.4.3 抑制消减杂交
• 1.4.4 反转录-聚合酶链反应
• 1.4.5 实时逆转录聚合酶链式反应
• 1.4.6 DNA微阵列
• 1.5 植物基因功能研究方法
• 1.5.1 大肠杆菌表达体系
• 1.5.2 酵母表达体系
• 1.5.3 RNA干扰技术
• 1.6 本实验研究的目的及意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要的实验仪器和试剂
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 水稻胚乳的收取
• 2.3.2 水稻胚乳淀粉的提取
• 2.3.3 双波长分光光度法测定直链淀粉和支链淀粉的含量
• 2.3.4 水稻胚乳中淀粉合成代谢关键酶的酶活测定
• 2.3.5 RNA的分离与纯化（Trizol法）
• 2.3.6 RNA的甲醛变性凝胶电泳
• 2.3.7 紫外吸收检测RNA浓度与纯度
• 2.3.8 cDNA第一条链的合成（TaKaRa PimeScript RT-PCR Kit）
• 2.3.9 RT-PCR
• 2.3.10 获取基因cDNA
• 2.3.11 1584bp的Wx'基因在大肠杆菌（E.coli BL21（DE3）plysS）中表达
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 5个水稻品系成熟胚乳中淀粉含量测定
• 3.1.1 直链淀粉、直链淀粉标准曲线方程的制作
• 3.1.2 不同品系淀粉中直链、支链淀粉含量比例的比较
• 3.2 5个水稻品系胚乳中淀粉代谢关键酶的酶活
• 3.2.1 ADPG焦磷酸化酶酶活变化
• 3.2.2 颗粒淀粉合成酶酶活变化
• 3.2.3 可溶性淀粉合成酶酶活变化
• 3.3 5个水稻品系的6个基因在8个不同时期的RNA表达差异
• 3.3.1 水稻胚乳RNA的提取及甲醛凝胶电泳
• 3.3.2 水稻胚乳中6个淀粉合成相关酶基因分别在8个时期的表达差异
• 3.4 获取OsGBSSI基因的cDNA片段
• 3.5 测序结果
• 3.6 扩增1584bp Wx'基因
• 3.7 Wx'基因在大肠杆菌中表达
• 第四部分 讨论
• 4.1 5个水稻品系胚乳中淀粉含量的研究
• 4.2 5个水稻品系胚乳中淀粉代谢关键酶的酶活研究
• 4.3 6个淀粉合成相关关酶基因的不同时期及品系间表达差异研究
• 4.4 3个淀粉合成相关酶及其基因对淀粉合成的影响
• 4.5 OsGBSSI基因的CDS分析及Wx'基因的表达研究
• 4.6 针对Wx'基因的后续的研究
• 第五部分 结论与展望
• 参考文献
• 致谢