绵羊梅迪—维斯纳病毒核酸疫苗的制备及免疫学研究

论文摘要

Maedi-Visna病毒（Maedi-Visna virus,MVV）是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,主要侵染宿主的单核/巨噬细胞系的细胞,以损害绵羊的多种器官为特征。临床上以绵羊严重消瘦、呼吸困难、麻痹、跛行、由淋巴组织增生而致乳腺硬化、间质性进行性肺炎等为特征。梅迪-维斯纳病最早于1915年在美国的蒙大拿被发现,目前呈世界性分布。该病潜伏期长,可通过母羊哺乳及呼吸道和消化道广泛传播,无有效的药物和疫苗对其进行防制。从60年代后期开始,我国有报道绵羊梅迪-维斯纳病的发生,并于1984年首次从血清学角度确定了该病在我国的存在,1985年从血清学阳性的绵羊体内分离到该病毒。该病的传播对绵羊养殖业造成了严重的危害。本实验鉴于此原因对我所保存的MVV毒株进行序列分析,并与该病毒其他毒株进行了序列比较,及对其核酸疫苗进行了免疫学研究,以确定该病毒的来源,对该病的防制奠定了基础。MVV基因的克隆目的:对保存的来源于美国的MVV毒株（暂时用MVV-am表示）的基因进行克隆、测序及序列分析,通过与原美国株MVV-85/34和亲本株MVV-1514相比,确定其变异率,同时为其核酸疫苗的研究搭建平台。方法:根据Genbank中发表的绵羊梅迪-维斯纳病毒美国株85/34的基因组序列（检索号:AY101611）设计合成了4对引物,用蛋白酶K法提取MVV前病毒DNA,对主要基因片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果:与原美国株MVV-85/34相比,MVV-am在传代过程中发生了变异,变异率约为3.1%。其中MVV-am的LTR和pol基因相对变异较大,gag基因核心部分变异相对最小。和亲本株MVV-1514相比变异较大,同源性约为90.1%,且发生了核苷酸的缺失。结论:我们保存的来源于美国的MVV毒株与原美国株MVV-85/34相比,核苷酸发生了变异,同源性大约为96.9%。而与亲本株MVV-1514相比,核苷酸变异相对较大。MVV主要保护性抗原基因的克隆和序列分析目的:针对MVV的主要保护性抗原gag基因（P51）进行克隆、序列分析及抗原性分析,以明确其抗原性,为MVV核酸疫苗的构建奠定分子基础。方法:根据国外发表的MVV美国株的gag基因及其核心片段的核苷酸序列设计引物,从MVV前病毒DNA中扩增gag基因片段,将其插入到pEGM-T easy克隆载体中,构建重组质粒pEGM-T-gag,转化大肠杆菌DH5α后,筛选阳性克隆进行序列测定和比较分析。利用ATHENPROT软件对其抗原性进行比较和分析。结果:本实验所克隆的gag基因与MVV美国株gag基因的核苷酸和氨基酸的同源性为别为98.2%和96.9%;gag基因核心片段编码蛋白的抗原性与MVV-85/34及MVV-1514株基本一致。结论:克隆得到gag基因片段,且该基因编码蛋白具有较高的抗原性。MVV核酸疫苗真核表达载体的构建及表达目的:构建MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag并转染COS-7细胞,检测核酸疫苗和重组质粒在真核细胞中瞬时表达的情况。方法:将克隆的gag基因片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/TO中,构建了MVV核酸疫苗pcDNA5/TO-gag。将上述质粒以及空载体pcDNA5/TO用脂质体介导法转染COS-7细胞48小时后,经免疫组化、ELISA、western blot及RT-PCR等方法检测重组质粒在COS-7细胞中的表达。结果:免疫组化发现重组质粒pcDNA5/TO-gag转染的COS-7细胞在细胞核周围呈现棕色,说明重组真核表达质粒pcDNA5/TO-gag在COS-7细胞中有相应蛋白的表达,而

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 梅迪-维斯纳病概述
• 1.1.1 病性
• 1.1.2 历史与分布
• 1.1.3 临床症状与病理变化
• 1.1.4 致病机理
• 1.1.5 诊断
• 1.1.6 生态学
• 1.1.7 免疫与防制
• 1.2 MVV 及其疫苗研究进展
• 1.2.1 MVV 概述
• 1.2.2 MVV 的生物学特性
• 1.2.3 MVV 的分子生物学
• 1.2.4 MVV 保护性抗原基因及其疫苗研究进展
• 1.3 核酸疫苗及免疫佐剂的研究进展
• 1.3.1 核酸疫苗的概述
• 1.3.2 免疫佐剂概述
• 1.3.3 IL-2 的免疫佐剂作用
• 1.3.4 脂质体的研究进展
• 1.4 本项目研究的背景、内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 病毒和细胞
• 2.1.4 菌株、载体与质粒
• 2.1.5 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 绵羊MVV 基因克隆及序列分析
• 2.2.2 MVV 保护性抗原基因的克隆和序列分析
• 2.2.3 MVV 核酸疫苗的构建及体外表达
• 2.2.4 MVV 核酸疫苗对小鼠免疫效果的研究
• 2.2.5 pcDNA-IL-2 的构建及体外表达
• 2.2.6 山羊IL-2 对MVV 核酸疫苗的免疫佐剂研究
• 3 结果与分析
• 3.1 MVV 的培养及鉴定
• 3.1.1 MVV 对绵羊胎皮细胞及胎肺细胞的适应情况
• 3.1.2 病毒粒子的电镜检测结果
• 3.1.3 MVV 细胞抗原交叉实验
• 3.2 MVV 各段基因的克隆和序列分析
• 3.2.1 MVV 各片段PCR 扩增
• 3.2.2 MVV 主要基因片段序列测定及同源性比较
• 3.3 MVV 保护性抗原基因的克隆和序列分析
• 3.3.1 MVV gag 基因的PCR 扩增
• 3.3.2 pGEM T-gag 重组质粒的酶切鉴定
• 3.3.3 gag 基因序列测定及分析
• 3.3.4 MVV gag 编码蛋白的抗原性分析
• 3.4 重组真核表达质粒的构建及体外表达检测
• 3.4.1 pcDNA5/TO-gag 重组阳性克隆的鉴定
• 3.4.2 ELISA 法对重组质粒表达的检测
• 3.4.3 免疫组化法对重组质粒表达的检测
• 3.4.4 RT-PCR 法对重组质粒表达的检测
• 3.4.5 western-blot 法对重组质粒表达的检测
• 3.5 MVV 核酸疫苗对小鼠的免疫效果研究
• 3.5.1 MVV 抗体检测
• 3.5.2 小鼠淋巴细胞转化实验
• 3.5.3 小鼠淋巴细胞IL-4 和IFN-γ分泌水平检测
• 3.6 山羊 IL-2 对MVV 核酸疫苗免疫效果影响的研究
• 3.6.1 IL-2 基因PCR 扩增
• 3.6.2 pMD18-T-IL-2 重组阳性克隆的鉴定
• 3.6.3 IL-2 序列测定
• 3.6.4 pcDNA5/TO-IL-2 重组阳性克隆的鉴定
• 3.6.5 pcDNA5/TO-IL-2 转染COS-7 细胞的ELISA 检测
• 3.6.6 pcDNA5/TO-IL-2 转染COS-7 细胞的RT-PCR 检测
• 3.6.7 pcDNA5/TO-IL-2 作基因佐剂后MVV 抗体检测
• 3.6.8 pcDNA5/TO-IL-2 对淋巴细胞转化实验的影响
• 3.6.9 pcDNA5/TO-IL-2 作基因佐剂IL-4 和IFN-γ检测
• 4 讨论
• 4.1 MVV 对绵羊细胞的感染及 MVV 的变异
• 4.2 MVV 主要保护性基因的克隆
• 4.3 重组质粒在真核细胞中的表达及检测
• 4.4 MVV 核酸疫苗对小鼠免疫作用
• 4.4.1 细胞免疫作用
• 4.4.2 体液免疫作用
• 4.5 佐剂对核酸疫苗的免疫效应
• 4.5.1 脂质体的免疫佐剂效应
• 4.5.2 IL-2 的基因佐剂效应
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间发表的学术论文