论文摘要
本研究在考察自然霉变玉米污染饲粮对断奶仔猪生产性能和营养物质利用影响的基础上,以原代培养猪小肠上皮细胞为模型,进一步研究镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）单独或联合作用对猪小肠上皮细胞的增殖、损伤、相关消化酶活性和养分吸收的影响以及与相关消化酶及转运载体基因表达之间的关系。研究共包括四个试验。试验一自然霉变玉米污染饲粮对断奶仔猪生产性能及营养物质消化代谢的影响本试验研究了自然霉变玉米污染饲粮对断奶仔猪生产性能、器官相对重、小肠黏膜形态结构、养分利用率和血清生化参数的影响。采用单因素试验设计,将75头始重为8.04±0.64kg的去势约×荣仔猪,随机分为3组,每组5个重复,每组随机接受一种试验饲粮。试验饲粮用自然霉变的玉米（每千克含:7966μg DON,2600μg ZEN）分别以25%和50%的比例等量替换基础饲粮中的正常玉米配制而成,以基础饲粮为对照组,进行28 d试验。结果表明:1.霉玉米污染的饲粮,降低了仔猪的生产性能,随饲粮中霉玉米替代比例的增加,采食量和日增重呈线性或二次曲线下降（P＜0.05）。2.随饲粮中霉玉米替代比例的增加,肾脏相对重呈二次曲线下降（P＜0.05）,脾脏相对重呈线性增加（P＜0.05）,而肝、胰、胸腺的相对重不受影响（P＞0.05）。25%霉玉米饲粮降低胆囊相对重（P＜0.05）。3.随饲粮中霉玉米替代比例的增加,十二指肠和空肠前段的绒毛高度和黏膜厚度呈线性或二次曲线降低（P＜0.05）,十二指肠前段隐窝呈线性加深（P＜0.05）,空肠前段隐窝呈线性或二次曲线加深（P＜0.05）,各肠段绒毛宽度受到显著影响（P＜0.05或P＜0.01）。4.有机物质、蛋白质、磷的表观消化率和蛋白质生物学价值随饲粮中霉玉米替代比例的增加呈线性或二次曲线降低（P＜0.05）,钙的表观消化率呈线性降低（P＜0.05）。5.随饲粮中霉玉米替代比例的增加,试验进行至第14 d猪血清中GPT活性和ALB浓度呈二次曲线降低（P＜0.05）,在28 d却无变化（P＞0.05）。血清TP浓度在14 d不受影响（P＞0.05）,28 d呈现二次变化（P＜0.05）。血清GLO、A/G和BUN不受影响,IgG、IgA、IgM的浓度前后无变化（P＞0.05）。本研究结果揭示,自然霉变玉米污染饲粮导致仔猪生产性能下降、小肠黏膜结构损伤、养分表观消化率下降以及部分血清生化指标受到影响。试验二镰刀菌毒素对仔猪肠上皮细胞增殖及氧化损伤的影响本试验以原代培养的新生仔猪肠上皮细胞（porcine intestinal epithelium cell,pIEC）为研究模型,采用4×4因子试验设计,研究DON和ZEN对pIEC增殖及氧化损伤的影响。DON终浓度分别为0、2、4和6μg/mL,ZEN终浓度分别为0、1、5和10μg/mL,试验共16个处理。将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,每个处理设11个重复孔,其中每个处理的5个重复,在细胞贴壁培养至第6 d,分别攻毒培养3、6、12、24和48 h后,采用MTT法分析细胞增殖;每个处理余下的6个重复孔中的细胞继续培养至第10 d后,攻毒培养24 h,用于LDH分析。细胞悬液接种于24孔细胞培养板,每个处理设10个重复孔,细胞贴壁培养至第10d,攻毒培养24 h,用于氧化应激指标测定。结果表明:1.DON在2μg/mL、ZEN在5μg/mL及以上浓度单独或联合作用于pIEC显著降低其增殖。两毒素联合作用于pIEC,对降低其增殖存在显著的互作效应（P＜0.01）,DON对细胞增殖的抑制效应比ZEN大。2.DON在2μg/mL、ZEN在10μg/mL及以上浓度单独或联合作用于pIEC显著增加乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的逸出率。DON对pIEC膜的损伤作用比ZEN大。3.DON在2μg/mL、ZEN在5μg/mL及以上浓度单独作用于pIEC,显著增加丙二醛（malondialdehyde,MDA）生成量（P＜0.05）。两毒素联合作用于pIEC,DON使MDA显著增加的最低危害作用水平（lowest observed adverse effect level,LOAEL）是4μg/mL,DON、ZEN对MDA的生成量有极显著的交互效应（P＜0.01）,DON对MDA生成量的影响比ZEN大。4.DON单独或与ZEN联合作用显著降低pIEC内谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的LOAEL是2μg DON/mL。ZEN单独作用显著降低GSH含量的LOAEL是1μg/mL（P＜0.05）,显著降低T-SOD活性的LOAEL是10μg/mL。两毒素联合作用于pIEC,ZEN降低GSH含量的LOAEL是1μg/mL,降低T-SOD活性的LOAEL是5μgZEN/mL。5.DON、ZEN联合作用pIEC,降低细胞内GSH含量和T-SOD活性的程度大于毒素各自的单一作用。对细胞抗氧化系统的损伤DON比ZEN强,并在降低GSH含量上表现出亚加性效应。上述试验结果表明,DON、ZEN可造成pIEC的氧化损伤并抑制其增殖,对细胞氧化损伤作用的大小为:DON＞ZEN。试验三镰刀菌毒素对仔猪肠上皮细胞养分消化吸收的影响试验二表明,DON和ZEN引起pIEC氧化损伤,导致细胞膜完整性受损,因此会影响养分的消化吸收。为了探索DON、ZEN对原代培养pIEC黏膜酶活及养分吸收的影响,本试验采用3×3因子设计,DON的浓度设为0、2、4μg/mL,ZEN浓度设为0、5、10μg/mL,试验共9个处理,每个处理设10个重复孔,考察DON、ZEN对pIEC的蔗糖酶、异麦芽糖酶、Na`+-K+ATPase活性及葡萄糖和二肽（以头孢氨苄为底物）吸收的影响。结果表明:1.DON单独作用于pIEC,降低蔗糖酶活性、葡萄糖和头孢氨苄吸收的LOAEL是2μgDON/mL（P＜0.05）,降低麦芽糖酶和Na+-K+ATPase活性的LOAEL是4μgDON/mL（P＜0.05）。2.ZEN单独作用于pIEC,降低蔗糖酶和Na+.K+ATPase活性及葡萄糖吸收的LOAEL是10μg/mL（P＜0.05）,降低头孢氨苄吸收的LOAEL是5μg ZEN/mL,对麦芽糖酶的活性无显著影响（P＞0.05）。3.DON与ZEN联合作用于pIEC,在一定的浓度范围内以加性或亚加性效应的方式降低蔗糖酶、麦芽糖酶和Na+-K+ATPase的活性（P＜0.01）。DON与低浓度ZEN联用在降低葡萄糖的吸收上表现出协同效应,与高浓度ZEN联用在降低葡萄糖的吸收上表现亚加性效应（P＜0.05）,而对头孢氨苄的吸收无交互作用（P＞0.05）。上述结果揭示,DON和ZEN对pIEC蔗糖酶、麦芽糖酶和Na+-K+ATPase活性及葡萄糖和头孢氨苄的吸收有显著影响,对蔗糖酶活性、Na+-K+ATPase活性、葡萄糖及头孢氨苄吸收的影响,DON比ZEN敏感,而对麦芽糖酶活性的影响,在两者联合作用时,ZEN比DON敏感。试验四镰刀菌毒素对仔猪肠上皮细胞养分消化吸收相关酶及转运载体基因表达的影响试验三揭示,DON和ZEN影响了pIEC黏膜酶活及养分吸收,因此本试验采用3×3因子设计,进一步探究DON、ZEN影响黏膜酶活及养分吸收的可能机制。DON的浓度设为0、2、4μg/mL,ZEN浓度设为0、5、10μg/mL,试验共9个处理,每个处理设3个重复孔,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR考察了DON、ZEN对蔗糖酶.异麦芽糖酶（sucrase-isomaltase,SI）、亮氨酰氨肽酶（leucylaminopcptidase,LAP）、Na+-葡糖共转运载体（Na+/glucose cotransport transporter,SGLT1）和二肽转运载体（dipeptide transporter,PepT1）基因表达的影响。结果表明:1.DON使SI、LAP及PopT1 mRNA表达水平下调的LOAEL为2μg/mL（P＜0.05）,在低水平（2μg/mL）可使SGLT1 mRNA表达下调（P＜0.05）,较高水平（4μg/mL）对SGLT1mRNA的表达无影响（P＞0.05）。2.ZEN单独作用不影响SI和PepT1 mRNA的表达（P＞0.05）,在10μg ZEN/mL使LAP和SGLT1 mRNA的表达水平下调（P＜0.05）。3.DON、ZEN联合作用于pIEC,DON使SI、LAP、SGLT1及PepT1的mRNA表达水平下调的LOAEL为2μg/mL（P＜0.05）,ZEN不影响上述指标mRNA的表达（P＞0.05）。DON与ZEN协同下调SI和PepT1 mRNA的表达,对LAP和SGLT1 mRNA的表达无互作效应。上述结果揭示,DON可下调SI、LAP、SGLT1及PepT1mRNA的表达,ZEN对LAP和SGLT1 mRNA的表达有轻微的下调作用。DON与ZEN协同下调SI和PepT1 mRNA的表达,DON对消化相关酶活性及转运载体mRNA表达的影响比ZEN大。上述体内和体外试验结果表明,镰刀菌毒素DON、ZEN通过抑制细胞增殖、损害pIEC内的抗氧化系统使细胞受损,从而导致动物消化道形态结构异常,并通过下调相关消化酶及转运载体的基因表达,降低养分吸收而导致动物生产性能下降,表现出抗营养效应。
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