艰难梭菌细胞毒素B羧基末端功能区的克隆、表达及其生物学特性

论文摘要

目的: 艰难梭菌（Clostridium difficile）是造成抗生素相关性结肠炎及伪膜性结肠炎（PMC）的最常见致病菌。该菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相关性腹泻及肠炎的发病率及死亡率明显升高。Cdifficile产毒株准确快速的诊断、鉴定,对确定病源、控制其传播、有效治疗患者是极其重要的。国外建立的酶联免疫吸附实验（ELISA）检测C difficile毒素,其优点是灵敏度和特异度高,结果可在2-4小时内得出,从而更适合指导临床实际工作,故被大力推广,但国内对艰难梭菌诊断试剂研究较少,尤其是对Cdifficile细胞毒素B（cdtB）的检测。本课题利用cdtB特点,以基因工程技术对其羧基末端功能区进行克隆、表达并纯化出该蛋白,制备多克隆抗体,主要目的在于对该重组蛋白生物学特性进行研究和探索,以期建立一种可快速、稳定的检测出Cdifficile细胞毒素B的ELISA诊断试剂。 方法: 1、基因工程技术制备cdtB膜受体结合区域的重组蛋白。以C difficile标准株VPI10463的全长DNA序列为模板,利用PCR技术扩增出编码cdtB膜受体结合区域的功能基因,经EcoRI和XhoI双酶切后,定向插入同样经这两种酶双酶切的原核表达载体pET-22b（+）中,在DNAT4连接酶作用下进行连接以获得重组质粒。重组质粒经测序,结果与GenBank记录的Cdifficile VPI10463的cdtB

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 艰难梭菌细胞毒素B膜受体结合蛋白基因的克隆、表达
• 1.1 引言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果
• 1.3.1 菌株特点
• 1.3.2 pET—cdtBR重组质粒的构建
• 1.3.3 重组质粒pET—cdtBR的序列分析
• 1.3.4 cdtBR基因在大肠杆菌中的表达
• 1.4 讨论
• 第二章 重组蛋白的纯化及免疫原性的体外评价
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组蛋白的纯化
• 2.3.2 重组蛋白的浓度
• 2.3.3 重组蛋白的免疫原性
• 2.4 讨论
• 第三章 抗艰难梭菌B毒素膜受体结合蛋白多克隆抗体的制备及特分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 多克隆抗血清的制备
• 3.3.2 特异性鉴定
• 3.3.2.1 免疫双扩散
• 3.3.2.2 测定多抗效价
• 3.3.2.3 多抗的免疫印迹实验
• 3.3.3 ELISA的特异性检测
• 3.4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 成果
• 致谢
• 第一军医大学学位论文原创性声明及授权书