玉米抗铝毒基因ZmSTAR1和ZmSTAR2的生物学功能研究

论文摘要

铝是地壳中含量最丰富的矿质元素之一,一般情况F不会对作物生长产生影响。但是随着pH的降低,酸性土壤中可溶性铝离子浓度上升。Al3+通过抑制细胞分裂等方式,影响根系伸长,最终抑制根系对水分和矿质养分的吸收,导致作物严重减产。玉米是我国重要的粮食作物,在农业生产和国民经济中占有重要的作用。在我国,酸性土壤约占耕地面积的21%,并且还有扩大的趋势,这将极大的影响我国玉米的总产量。因此,分离、克降抗铝毒胁迫基因,研究其抗铝毒的功能与表达特点,探讨其在玉米中的耐铝毒机制,并利用这些基因提高农作物抗铝毒能力,对于保障玉米等作物的粮食供给和开发利用酸性土壤具有重要意义。本实验通过同源比对,获得了与水稻抗铝毒基因OsSTAR1和OsSTAR2同源的玉米ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的cDNA序列,并对其进行系统进化树分析和结构域分析。此后对ZmSTAR1和ZmSTAR2基因启动子区域顺式元件进行分析,探索其顺式元件的类型。然后以玉米抗铝毒自交系178为材料,利用同源克隆的方法克隆了玉米ZmSTAR1和ZmSTAR2基因,构建过量表达载体pCPB-ZmSTAR1（?）pCPB-ZmSTAR2,通过农杆菌转化将其转入烟草和玉米18-599（白）自交系。此外,本试验还通过qRT-PCR技术,检测ZmSTAR1和ZmSTAR2基因在不同条件下的时空表达情况。另外,构建了35S::ZmSTAR1-GFP和35S::ZmSTAR2-GFP瞬时表达载体,利用基因枪轰击洋葱上表皮的方法,对ZmSTAR1和ZmSTAR2进行亚细胞定位。最后,本实验还通过酵母双杂交检测ZmSTAR1和ZmSTAR2是否能够发生相互作用。主要研究结果如下1通过对玉米ZmSTAR1和ZmSTAR2的分子特性进行分析,发现这两个蛋白具有ABC转运复合体ATP结合亚基的结构域,定位于膜上,其启动子区域具有铝胁迫基因结合位点及其他顺式调控元件。系统进化树分析发现ZmSTAR1和ZmSTAR2与其水稻OsSTAR1和OsSTAR2的同源性最高。2构建过量表达载体pCPB-ZmSTARl和pCPB-ZmSTAR2,并通过农杆菌介导法分别转化玉米和烟草,经PCR检测及基因测序证实这两个载体已经整合到玉米18-599和烟草W38中。3洋葱表皮细胞定位结果显示ZmSTAR1和ZmSTAR2定位于细胞膜上。4通过qRT-PCR技术对ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的时空表达模式分析,发现ZmSTAR1和ZmSTAR2基因在幼苗的不同组织部位都表达,但根部的表达水平最高；表达受H+和Al3+诱导表达,且在根部的诱导最强；表达水平并不一致,受Al3+诱导时ZmSTAR1总体表达水平比ZmSTAR2基因高；在不同基因型玉米中并不总是协同表达。5将酵母双杂交结果证实ZmSTAR1和ZmSTAR2能够发生相互作用。综上所述,ZmSTAR1和ZmSRAR2编码玉米中一类与铝毒胁迫相关的ABC转运蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 酸性土壤铝毒胁迫现状
• 1.2 铝毒胁迫作用机制
• 1.2.1 干扰细胞骨架
• 1.2.2 干扰信号转导
• 1.2.3 诱导产生活性氧
• 1.2.4 其他作用机制
• 1.3 植物拮抗铝毒的机制
• 1.3.1 植物拮抗铝毒胁迫的外部机制
• 1.3.2 植物拮抗铝毒胁迫的内部机制
• 1.3.3 抗铝毒胁迫基因的研究进展
• 1.4 ABC转运载体的研究进展
• 1.4.1 ABC转运载体的特点
• 1.4.2 水稻OsSTAR1+OsSTAR2 ABC转运复合体的研究进展
• 1.4.3 拟南芥中耐铝毒ABC转运蛋白的研究进展
• 1.5 立题依据
• 2 材料和方法
• 2.1. 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体和菌株
• 2.1.3 主要试剂与仪器
• 2.1.4 培养基种类及配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因序列的获得
• 2.2.2 ZmSTAR1和ZmSTAR2的分子特性分析
• 2.2.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的时空表达模式分析
• 2.2.4 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的遗传转化
• 2.2.5 ZmSTAR1和ZmSTAR2的亚细胞定位
• 2.2.6 ZmSTAR1和ZmSTAR2的互作检测
• 3 结果分析
• 3.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2的分子特性分析
• 3.1.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2目的序列的获得及保守结构分析
• 3.1.2 ZmSTAR1和ZmSTAR2的系统进化树分析
• 3.1.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2启动子区域分析
• 3.2 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的克隆
• 3.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因表达特性分析
• 3.3.1 RNA完整性的鉴定及基因组DNA的去除
• 3.3.2 标准曲线的制作与溶解曲线
• 3.3.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的表达特性分析
• 3.4 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因在玉米和烟草中的遗传转化
• 3.4.1 pCBP-ZmSTAR1和pCBP-ZmSTAR2植物过量表达载体的构建
• 3.4.2 农杆菌介导的pCBP-ZmSTAR1和pCBP-ZmSTAR2过量表达载体转化玉米及烟草的研究
• 3.4.3 pCBP-ZmSTAR1和pCBP-ZmSTAR2过量表达载体转基因玉米和转基因烟草的分子检测
• 3.5 ZmSTAR1和ZmSTAR2蛋白的亚细胞定位
• 3.5.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2亚细胞定位的生物信息学预测
• 3.5.2 瞬时表达载体pCHF3-ZmSTAR1-GFP和pCHF3-ZmSTAR2-GFP的构建
• 3.5.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2在洋葱表皮上的亚细胞定位
• 3.6 ZmSTAR1和ZmSTAR2的互作检测
• 3.6.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2酵母双杂交载体的构建
• 3.6.2 ZmSTAR1与ZmSTAR2的酵母双杂交分析
• 4 结果讨论
• 4.1 ZmSTAR1和ZmSTAR2的分子特性
• 4.2 ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的表达特性
• 4.2.1 pH对ZmSTAR1、ZmSTAR2基因表达的影响
• 3+对ZmSTAR1和ZmSTAR2基因表达的影响'>4.2.2 不同浓度Al³⁺对ZmSTAR1和ZmSTAR2基因表达的影响
• 4.2.3 不同部位间ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的表达差异
• 4.2.4 抗铝毒胁迫自交系178与铝毒敏感自交系Mo17间ZmSTAR1和ZmSTAR2基因的表达差异
• 4.3 ZmSTAR1和ZmSTAR2的亚细胞定位
• 4.4 ZmSTAR1和ZmSTAR2的互作关系
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢