肺炎支原体P30粘附素基因的原核表达和初步应用

论文摘要

第一部分 肺炎支原体 P30 蛋白的原核表达及初步分析 目的:通过体外扩增 MP 的 P30 粘附素基因,构建 P30 基因的原核表达质粒,在 E.coli 中表达并鉴定;用亲和层析法分离纯化 rP30 蛋白;以纯化的 rP30 蛋白为抗原建立间接 dolt-ELISA 法,用临床病例评价 rP30 蛋白在 MP 感染免疫学诊断中的价值;为探讨 MP 的致病机制和临床血清学诊断提供新的依据。 方法:用引物修饰法将 P30 基因中唯一的“UGA”码突变为“UGG”后作为上游引物,并带上 BamH I 的酶切位点,下游引物带 Sal I 位点;以 MP 基因组 DNA 为模板,用 PCR 方法扩增 P30 基因,将其定向克隆入 pET32a（+）质粒,构建 pET32a（+）/P30 重组体;测序鉴定正确后用重组体转化 BL21（DE3）菌,在 IPTG 诱导下进行表达;表达产物经SDS-PAGE 鉴定后用阳性 MP 感染患儿血清做 Western-blot 检测其抗原性;再用 Ni-NTA 树脂纯化,以纯化并复性后的 rP30 蛋白为抗原建立间接 dolt-ELISA 法,对 40 份临床疑似 MP 感染患儿血清进行检测。 结 果 :成功扩增出不含“UGA” 码的P30基因并构建出pET32a（+）/P30 重组质粒。该重组体在适当 IPTG 诱导下,在 BL21（DE3）菌中表达出了分子量约为 52kD 的 Trx-P30 融合蛋白。重组蛋白以包重庆医科大学硕士研究生学位论文 5涵体形式表达,表达量约占全菌蛋白的 13%;经 Ni-NTA 树脂纯化后得到了纯度约为 93%的重组蛋白。Western-blot 证实 rP30 蛋白可以和阳性 MP 感染患儿血清发生特异性结合反应。用 rP30 蛋白建立的间接dolt-ELISA 法,其敏感性和特异性分别是:95.45%、72.22%,准确度为 85%。结论:成功构建出原核表达载体 pET32a（+）/P30;在 E.coli 中表达出了完整的 MP P30 蛋白;rP30 蛋白具有良好的抗原性;经 Ni-NTA树脂纯化后得到较高纯度的目的蛋白;此重组蛋白为 MP 感染检测用抗原、抗体的选择及 MP 感染致病机制的研究奠定了基础。第二部分 小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立目的:建立 BALB/C 小鼠的 MP 肺部感染模型,探索小鼠急性MP 感染的过程。方法:BALB/C 小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ两组,Ⅰ组在 0、1、2 天滴鼻接种 MP 菌液 3 次,Ⅱ组在 0 天滴鼻接种小剂量 MP 菌液 1 次后于8、9 天再接种和Ⅰ组相同的 MP 菌液 2 次,均设立不同剂量、批次的生理盐水对照组。全部实验动物在 3～18 天内分批处死。所有小鼠均取肺组织做病理切片。以组织病理学评分来确定小鼠的肺部炎症反应程度。取肺组织匀浆及 BALF 进行 MP 培养做病原学检测。结果:接种后实验动物全部存活无死亡例。实验组动物均出现不同程度的 MPP 样病理改变,组织病理学评分为 1.5～14.3 分,分别于第 5、6 天和第 11 天达到最高,平均分为 4.9 分;Ⅰ组实验组动物多

论文目录

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• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 肺炎支原体P30 蛋白的原核表达及初步分析
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 第二部分 小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 讨论
• 全文参考文献
• 全文小结
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文题录