转基因水稻抗病性的遗传和对发育调控的机理研究

论文摘要

水稻纹枯病（Rhizoctonia solani）、稻瘟病（Magnaporthe grisea）和白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryze）是我国水稻的“三大”病害。由于水稻种质库中尚未发现有对纹枯病可利用的高水平抗源、稻瘟病生理小种变异快,这使得选育具有广谱抗性并且可以稳定遗传的抗病品种显得异常重要。利用外源几丁质酶基因和葡聚糖酶基因提高水稻抗性是一种可能的选择。本实验室的前期工作中,首次将水稻几丁质酶基因（RCH10）和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因（AGLU1）双价基因表达盒（Z100）转化水稻,经初步温室检测提高了对水稻纹枯病和稻瘟病的抗性。超表达的OsNPR1转基因植株显著增强了对白叶枯病的抗性,但转基因植株有矮化,结实率降低现象。本研究对Z100转基因水稻后代进行进一步的田间抗病以及表达盒中基因的遗传稳定性进行分析。经PCR和GUS检测,结果表明T1代转基因植株存在分离现象,分离比例具有多样性,有的符合孟德尔3:1、15:1,有的不符合遗传规律,揭示了外源基因在基因组染色体上插入位点的随意性;在T3代转基因株系还发现NPT||基因100%传递给子代,而整个表达盒传递的为80%,其中RCH10基因丢失了15%,AGLU1基因丢失了5%,说明T-DNA上的遗传信息在子代发生了丢失。经过4代的纹枯病和稻瘟病抗性检测,获得5个双抗株系,经Southern检测,表明外源基因已整合到基因组中,Northern杂交结果表明两个基因表达水平相同且与抗病能力存在剂量效应。同时发现纹枯病和稻瘟病接种诱导了OsPR1b基因的表达,转基因植株中表达水平高于野生型,说明转基因加强了水稻自身防卫基因的表达,并可能与转基因一起具有协同抗病功能。利用免疫金标记技术,跟踪了病原菌接种后RCH10和AGLU1在转基因植株中的的亚细胞定位和动态表达,结果发现转基因植株中金颗粒在叶绿体内的分布密度远远高于其他细胞器;Z100转基因植株在受到病原菌侵染24 h后,抗菌蛋白会从叶绿体向细胞质和细胞壁分泌,最终可能聚集在病原菌侵染部位,行使杀菌功能,初步明确了抗病转基因植株中外源蛋白表达、积累以及转运的时空特点、表达量与抗病性的关系,这一现象尚属首次发现。转基因在Z100转基因植株中酶活力显著高于野生型,但在诱导后的不同时间段表达一直较高且水平相近,这是因为受组成型启动子或增强子调控所致。氧化酶系统中,Z100抗病转基因水稻在纹枯病侵染后,丙二醛（MDA）含量增加和SOD的活性增强,揭示了转基因植物消除活性氧能力可能得到加强,减轻了对细胞膜的伤害,从而增强了抗病性。Z100转基因对植株千粒重和苗期发育等农艺性状有影响。转基因植株种子的千粒重比野生型显著减小,发芽势和发芽率也比野生型低,尤其对GA3处理敏感。基因表达分析结果表明GA信号途径基因GID1、SLR1、D1和GID2的转录水平在转基因植株和野生型中相似,而GA2ox1在转基因植株中的转录水平显著高于野生型。因此Z100转基因可能促进了苗期GA的失活,转基因植株早期苗期的植株矮小,可能与GA2ox1基因的高水平表达促使GA降解,导致内源活性GA缺乏有关。NPR1是植物系统获得性抗性（SAR）的关键调控因子。本实验室前期的工作证明了水稻ortholog OsNPR1的功能,发现OsNPR1转基因水稻对白叶枯病具有高度抗性,水稻中可能存在由水杨酸（SA）介导的SAR途径。但后续的研究发现高抗的转基因植株存在与Z100转基因类似的植株变矮性状,即OsNPR1转基因也影响了其它农艺性状的发育。为了进一步了解OsNPR1诱导的防卫反应和发育调节,对过表达OsNPR1基因（OsNPR1-OX）的矮化转基因水稻采用全基因组水稻基因芯片进行分析,发现OsNPR1抗病转基因引起差异表达基因共968条,其中上调796条,下调172条,其中部分基因与发育有关。初步揭示了OsNPR1调节的植物生理学过程及一些关键的目标基因。本研究的结果对于研究RCH10和AGLU1双价基因共转化和OsNPR1在抗性以及发育上的调控机制提供了新的方向,同时也提供了具有较高应用价值的高抗转基因株系,具有一定的育种应用价值。对于进一步从分子生物学上阐明抗病性激发对其它农艺性状的影响,为更好地进行抗病分子设计奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述 植物抗病反应以及抗病基因工程
• 一.植物的抗病反应
• 1 植物的抗病系统
• 2 植物R基因的克隆与功能分析
• 3 植物avr基因的克隆和功能分析
• 4 R和AVR的互做分子模式
• 5 植物的系统诱导防卫反应途径
• 6 抗病反应的信号分子转导
• 7 免疫反应与其它途径的互作
• 二.水稻抗病反应研究进展
• 1 水稻抗病基因的克隆与功能研究
• 2 水稻防卫反应和PR蛋白
• 三.水稻抗病基因工程研究进展
• 1 水稻的主要病害
• 2 水稻抗病基因工程
• 四.植物基因工程的现状和前景
• 1 国外转基因植物产业化现状
• 2 我国转基因产业化现状
• 本研究的意义、目的和主要研究内容
• 研究论文 转基因水稻抗病性的遗传和对发育调控的机理研究
• 第一部分:RCH10和AGLU1在水稻抗病和发育中的功能分析
• 第一章 高世代转基因抗病植株的选育
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 转基因水稻
• 1.1.2 纹枯病菌
• 1.1.3 稻瘟病菌株
• 1.1.4 RCH10、AGLU1的多克隆抗体
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因水稻PCR分析
• 1.2.2 转基因水稻Southern分析
• 1.2.3 转基因水稻Northern分析
• 1.2.4 转基因水稻Western分析
• 1.2.5 转基因水稻纹枯病抗性鉴定
• 1.2.6 转基因水稻稻瘟病抗性鉴定
• 1.2.7 转基因水稻的组织化学染色
• 1.3 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 外源基因在转基因后代的遗传分析
• 1代转基因植株的分离鉴定'>2.1.1 T₁代转基因植株的分离鉴定
• 2代转基因植株的分离鉴定'>2.1.2 T₂代转基因植株的分离鉴定
• 3代转基因植株双价基因的遗传分析'>2.1.3 T₃代转基因植株双价基因的遗传分析
• 2.2 外源基因在转基因后代的整合分析
• 2.3 外源基因在转基因后代的表达分析
• 2.4 转基因对OsPR1b基因的表达调控
• 2.5 外源基因在转基因后代的蛋白表达分析
• 2.6 转基因植株的抗病性
• 1代转基因植株的抗病性'>2.6.1 T₁代转基因植株的抗病性
• 2代转基因植株的抗病性'>2.6.2 T₂代转基因植株的抗病性
• 3代、T₄代转基因植株的抗病性'>2.6.3 T₃代、T₄代转基因植株的抗病性
• 3 讨论
• 第二章 RCH10和AGLU1的酶活性和亚细胞定位与抗病性的关系
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 水稻材料
• 1.1.2 纹枯病菌株和接种方法
• 1.1.3 胶体金探针
• 1.1.4 RCH10、AGLU1的多克隆抗体
• 1.2 方法
• 1.2.1 粗酶液的提取
• 1.2.2 几丁质酶活性测定
• 1.2.3 β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
• 1.2.4 胶体金免疫标记方法
• 2 结果与分析
• 2.1 纹枯病接种对转基因水稻中几丁质酶活性的影响
• 2.2 纹枯病接种对转基因水稻中葡聚糖酶活性的影响
• 2.3 RCH10、AGLU1在转基因植株中亚细胞定位
• 2.4 纹枯病菌诱导对RCH10、AGLU1在亚细胞中分布的影响
• 3 讨论
• 第三章 纹枯病菌对转基因水稻膜脂过氧化和抗氧化酶活性的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 水稻材料
• 1.1.2 纹枯病菌株和接种方法
• 1.2 方法
• 1.2.1 MDA含量的测定
• 1.2.2 酶液的提取以及酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 纹枯病接种对水稻叶片中MDA含量的动态变化
• 2.2 纹枯病接种对水稻叶片中SOD活性的影响
• 2.3 纹枯病接种对水稻叶片中CAT,GPX和APX活性的影响
• 2.4 纹枯病接种对水稻叶片中DHAR和GR活性的影响
• 3 讨论
• 第四章 转基因对种子千粒重、发芽和苗期生长的影
• 1 材料与方法
• 1.1 水稻材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 种子含水量、千粒重的测定
• 1.2.2 利用近红外广谱分析稻米品质
• 1.2.3 环境扫描电镜观察
• 1.2.4 种子发芽率和发芽势的测定
• 3敏感性实验'>1.2.5 对GA₃敏感性实验
• 1.2.6 基因转录水平的调控RT-PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因对千粒重及米质的影响
• 2.2 转基因对发芽势、发芽率和植株苗期长势的影响
• 3的敏感性'>2.3 转基因植株对外源GA₃的敏感性
• 2.4 转基因对GA信号途径和代谢途径基因表达的影响
• 3 讨论
• 第二部分:水稻SAR途径抑制发育的分子证据
• 1 材料和方法
• 1.1 水稻材料
• 1.2 Microarray分析
• 3敏感性实验'>1.3 对GA₃敏感性实验
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因株系G316对外源GA的敏感性
• 2.2 转基因株系G316和野生型TP309样本间基因表达谱差异分析
• 2.3 参与细胞发育的差异表达基因
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢