海甘蓝遗传转化体系的建立与优化

论文摘要

海甘蓝（Crambe abyssinica）是十字花科海甘蓝属植物,种子含油量为34.48%,其中芥酸含量为55%-62.50%。海甘蓝的种子油通常在工业上广泛应用。由于海甘蓝属于海甘蓝属且自花授粉植物,不用担心与芸薹属植物串粉而影响食用,因此可以通过转基因技术将其培育成为新型工业油料作物。本论文探讨了海甘蓝下下胚轴和子叶柄再生与转化体系的建立以及转基因过程中一些重要因素对转化再生的影响。首先我们探讨了卡那霉素对未转化海甘蓝苗的影响。随着卡那霉素的浓度提高,白化苗的比例呈上升趋势。接种15天和30天后卡那霉素浓度间差异都显著。在同一卡那霉素浓度下,时间越长,白化比例越高,只有5mg/L和10mg/L卡那霉素浓度有些意外。可能是此卡那霉素浓度较低,有些组培苗已适应了此卡那浓度。因此我们建议转化筛选时,卡那霉素浓度应高于10mg/L。研究表明NAA对于海甘蓝下胚轴转化再生影响显著。NAA为0.2mg/L时再生频率最高,之后随着NAA浓度升高,再生频率逐渐下降。将ZT从0mg/L提高到3mg/L,下胚轴再生频率有所提高；进一步提高ZT浓度再生频率则下降。TDZ为8mg/L时再生频率相对较高。适度提高6-BA浓度,下胚轴再生频率略有提高,进一步提高则会使再生频率大幅降低。统计分析表明ZT、TDZ和6-BA对下胚轴转化再生影响不显著。下胚轴长度对转化再生频率影响显著。下胚轴越短,转化再生频率越高。卡那霉素对下胚轴转化再生影响显著。卡那霉素浓度越高,下胚轴转化再生频率越低。综合考虑出芽频率和筛选效果,我们选择16mg/L卡那霉素作为下胚轴转化再生筛选压力,出芽后经过连续的筛选淘汰,最后均为阳性植株。AgNO3为0.5mg/L时下胚轴转化再生频率相对较高,但统计分析表明AgN03和活性菌液添加AS对下胚轴转化再生影响不显著。下胚轴预培养时间对下胚轴分化的影响显著。预培养2天转化再生频率最高,预培养时间太长或太短都不利于转化再生。农杆菌侵染时间对海甘蓝下胚轴的分化频率影响显著,侵染时间越长下胚轴转化再生能力降低。随着在共培养基中添加AS浓度的增加,下胚轴转化再生频率有所提高。统计分析表明AS浓度、农杆菌菌液浓度、不同浓度Cef/Car配比和pH值对下胚轴转化再生频率的影响不显著。6-BA对子叶柄转化再生影响显著。6-BA不利于子叶柄转化再生,6-BA浓度越高,转化再生频率越低。NAA浓度增加到1.5mg/L时,子叶柄转化再生频率达到最高,但更高的NAA则会降低转化再生频率。较高浓度的TDZ可以获得较高的转化再生频率统计软件分析表明NAA, TDZ和ZT对子叶柄芽转化再生影响不显著。卡那霉素对子叶柄转化再生频率影响显著。卡那霉素浓度为8mg/L时分化最高,之后随着卡那霉素浓度增加,子叶柄转化再生频率逐渐降低。综合考虑出芽频率和筛选效果,我们选择10mg/L卡那霉素浓度作为子叶柄转化筛选压力,出芽后逐渐提高筛选压力。AgNO3对子叶柄芽转化再生影响显著。AgN03为1mg/L时,子叶柄转化再生频率最高,再提高AgN03浓度则会降低转化再生频率。统计软件分析表明侵染时间、预培养和共培养时间对子叶柄转化再生影响不显著。对反复筛选后获得的具有Kan抗性T0代组培苗进行PCR,鉴定大量的阳性植株。将已经PCR鉴定的植株重新抽提DNA,去胶纯化。收集浓缩的DNA进行Southern blot,鉴定出一批阳性植株。利用海甘蓝下胚轴和子叶柄作为材料,将提高海甘蓝种子油中芥酸和蜡酯含量的载体导入海甘蓝中,获得大批转基因再生植株,为今后海甘蓝的利用奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略写
• 第一部分 文献综述
• 1.1 海甘蓝简介
• 1.1.1 海甘蓝的种植面积广
• 1.1.2 海甘蓝的产量
• 1.1.3 生育期较短,抗病性较差
• 1.2 海甘蓝主要脂肪酸是芥酸
• 1.2.1 芥酸在工业中的应用
• 1.2.2 海甘蓝含有丰富的芥酸
• 1.2.3 海甘蓝高芥酸新品种选育的背景及意义
• 1.3 提高海甘蓝种子芥酸含量
• 1.3.1 高芥酸植物油的前景
• 1.3.2 高芥酸海甘蓝的常规遗传育种
• 1.3.3 通过基因工程提高海甘蓝的芥酸含量
• 1.3.3.1 溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）基因的研究进展
• 1.3.3.2 fad2基因的研究进展
• 1.3.3.3 fae1基因的研究进展
• 1.4 蜡酯的应用前景
• 1.5 油菜主要脂肪酸的遗传和调控
• 1.6 植物遗传转化方法
• 1.6.1 农杆菌介导转化法
• 1.6.1.1 Ti质粒载体系统
• 1.6.1.2 T-DNA的转移及相关基因
• 1.6.2 外源基因直接导入法
• 1.6.2.1 真空渗入遗传转化法
• 1.6.2.2 花粉管通道法
• 1.6.2.3 基因枪法
• 1.6.3 植物基因转化中常用的筛选标记基因
• 1.6.4 植物转基因的报告基因
• 1.7 转基因的影响因素
• 1.7.1 外植体、农杆菌、培养条件和选择方法的影响
• 1.7.1.1 外植体对油菜再生的影响
• 1.7.1.2 基因型对油菜再生的影响
• 1.7.1.3 培养基对油菜再生的影响
• 1.8 转基因油菜的分子鉴定
• 1.8.1 外源基因的分子鉴定
• 1.8.1.1 PCR检测
• 1.8.1.2 Southern杂交
• 1.9 本课题研究思路
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 农杆菌
• 2.1.4 培养基
• 2.1.4.1 下胚轴培养基
• 2.1.4.2 子叶柄培养基
• 2.1.5 仪器和设备、酶与试剂
• 2.1.6 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.2 大肠杆菌的快速转化
• 2.2.3 质粒DNA的抽提
• 2.2.4 质粒DNA的纯化
• 2.2.5 TAKARA胶回收试剂盒回收DNA
• 2.2.6 农杆菌感受态的制备
• 2.2.7 农杆菌的转化（冻融法）
• 2.2.8 农杆菌介导海甘蓝遗传转化
• 2.2.8.1 农杆菌菌种的保存
• 2.2.8.2 海甘蓝种子的无菌萌发
• 2.2.8.3 工程感染菌株的准备
• 2.2.8.4 海甘蓝未转化苗的卡那霉素梯度实验
• 2.2.8.5 海甘蓝下胚轴再生培养基的初步筛选
• 2.2.8.6 海甘蓝下胚轴长度对转化再生的影响
• 2.2.8.7 海甘蓝下胚轴遗传转化培养基的优化
• 2.2.8.8 其它因素对海甘蓝下胚轴转化再生的影响
• 2.2.8.9 下胚轴的各个影响因素的最佳组合
• 2.2.8.10 海甘蓝子叶柄遗传转化体系的培养基优化
• 2.2.8.11 其他因素对海甘蓝子叶柄转化再生的影响
• 2.3 转化植株的初步鉴定
• 2.3.1 植物基因组总DNA的抽提和纯化
• 2.3.2 PCR扩增
• 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.4 Southern杂交
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 海甘蓝未转化苗的卡那霉素梯度实验
• 3.1.1 未转化苗接种到卡那霉素15天后结果
• 3.1.2 卡那霉素对海甘蓝未转化苗的影响（30d）
• 3.1.3 海甘蓝未转化苗在不同浓度卡那霉素接种15天和30天效果比较
• 3.2 下胚轴再生培养基的初步筛选
• 3.3 海甘蓝下胚轴遗传转化体系的优化
• 3.3.1 下胚轴长度对转化再生的影响
• 3.3.2 激素对海甘蓝下胚轴转化再生的影响
• 3.3.2.1 不同浓度NAA对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.2.2 不同浓度ZT对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.2.3 不同浓度TDZ对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.2.4 不同浓度BA对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3 其它因素对海甘蓝下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.1 摇农杆菌时加入AS对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.2 卡那霉素对下胚轴转化再生的影响
• 3对海甘蓝下胚轴的转化再生的影响'>3.3.3.3 AgNO₃对海甘蓝下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.4 共培养基中添加AS对下胚轴转化再生的影响
• 3.3.3.5 菌液OD=600值对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.6 下胚轴预培养的时间对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.7 农杆菌的不同侵染时间对海甘蓝下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.8 不同浓度Cef/Car配比对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.9 分化培养基的不同pH值对下胚轴的转化再生的影响
• 3.3.3.10 下胚轴的各个影响因素的最佳组合
• 3.3.4 海甘蓝子叶柄转化再生影响因素的研究
• 3.3.4.1 激素对海甘蓝子叶柄转化再生的影响
• 3.3.4.2 其它因素对海甘蓝子叶柄转化再生的影响
• 3.4 转基因海甘蓝的分子鉴定
• 3.4.1 PCR鉴定
• 3.4.2 Southern blotting鉴定
• 图版及其说明
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 未转化苗的卡那霉素的鉴定
• 4.2 转基因过程中相关因素的研究
• 4.2.1 外植体的再生体系
• 4.2.1.1 外植体的基因型
• 4.2.1.2 外植体的苗龄
• 4.2.1.3 外植体的切取部位和长度
• 4.2.2 培养基成分
• 4.2.2.1 激素成分
• 3对分化的影响'>4.2.2.2 AgNO₃对分化的影响
• 4.2.3 培养基和培养方法
• 4.2.3.1 发芽培养基
• 4.2.3.2 预培养基
• 4.2.3.3 共培养基
• 4.2.3.4 延迟培养基
• 4.2.3.5 分化培养基
• 4.2.3.6 筛选培养基
• 4.2.3.7 生根培养基
• 4.2.4 农杆菌的活力和侵染
• 4.2.4.1 农杆菌的活化
• 4.2.4.2 菌液浓度对转化的影响
• 4.2.4.3 农杆菌侵染时间的影响
• 4.2.5 分化时卡那霉素的影响
• 4.3 海甘蓝转化和筛选问题
• 4.4 本实验后续工作
• 4.5 前景与展望
• 参考文献
• 致谢