论文摘要
目的 构建多药耐药基因（MDR1）启动子靶向的CD-TK双自杀基因高表达载体,观察其对耐药白血病细胞K562-A02细胞的选择性杀伤作用,探讨耐药白血病的靶向性基因治疗。 方法 采用PCR方法从K562-A02细胞基因组DNA扩增多药耐药MDR1启动子片段,并在其两端分别连接NdeⅠ和HindⅢ酶切位点,插入到具有相同酶切位点的pcDNA3-TK质粒中自杀基因TK的上游,通过电泳及DNA测序证实连接准确。获得含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-TK。用BamHⅠ单酶切pcDNA3-MDR1-Promoter-TK及pcDNA3-CD-TK,通过基因重组技术将CD基因连接到TK基因的上游,通过电泳及DNA测序证实连接准确。获得含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。通过脂质体介导的基因转染技术转入白血病细胞系K562-A02和K562细胞中,通过G418筛选获得稳定转染的细胞株。RT-PCR鉴定TK、CD基因的表达,以未转染细胞做对照,加用不同浓度的GCV、5-FC培养4天,MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果PCR扩增所得MDR1启动子片段的长度和序列通过电泳及DNA测序得到证实,采用PCR扩增及DNA测序证实pcDNA3-TK质粒中插入的MDR1启动子大小、位置及方向均正确。经限制性内切酶单酶切peDNA3-CD-TK获得1.3KbCD基因,通过基因重组技术成功将其插入同样酶切后的pcDNA3-MDR1-Promoter-TK质粒TK基因的上游,采用PCR扩增及DNA测序证实插入的CD基因的大小、位置及方向正确。成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。经脂质体转染入K562、K562-A02细胞内,RT-PCR鉴定CD、TK基因在多药耐药细胞株K562-A02中得到了表达,而敏感株不表达。加入GCV、5-FC后耐药白血病细胞较不耐药的白血病细胞有明显的杀伤效果,细胞存活率下降,联合用药组较较单药组细胞存活率更低,同时诱导细胞凋亡率也最高。
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