论文摘要
第一章:猪干扰素-alpha多基因家族的结构和性质研究家猪基因组测序计划（Swine Genome Sequencing Project）提供的序列数据使得我们能够对猪IFN-α多基因家族的性质进行系统的分析。通过BLAST的方法,我们从已提交的序列工作草图中获得了16条IFN-α亚型的基因序列（Porcine interferon-α,PoIFN-α）,其中包括14条功能基因和2条假基因。多序列比对发现,有6条功能基因编码的蛋白在C端出现了8个氨基酸的缺失。构建的PoIFN-α多基因家族系统发生树揭示各亚型之间的进化关系。除此以外,对PoIFN-α蛋白分子C端的进化速率分析和阳性选择分析说明C末端的缺失不是某些亚型向假基因进化的标志,而是在基因组中保持进化优势的一种策略。为了进一步分析PoIFN-α家族的性质,从猪的肝脏基因组中分离出了8种不同的PoIFN-α亚型基因,然后将这些基因克隆入真核表达载体中,筛选阳性克隆后重组质粒转染BHK-21细胞并表达48小时收集上清液。转染效率通过荧光定量RT-PCR标定,使其保持一致。分别利用WISH细胞/VSV病毒和PK-15细胞/PRV病毒两种干扰素检测系统测定细胞转染上清液中的抗病毒活性。实验结果表明完整的PoIFN-α亚型的抗病毒活性在WISH细胞中比C端缺失的亚型高2-50倍,在PK-15细胞中比C端缺失的亚型高15-55倍。但是没有发现尾部的缺失对PoIFN-α的酸稳定性产生影响。为了进一步分析PoIFN-α各亚型在不同病毒诱导条件下的表达情况,我们采用了两种PCR检测策略:对每种亚型设计特异性引物检测和设计PoIFN-α通用引物检测。实验结果表明,在Poly IC-DEAE-dextran诱导的PK15细胞中,PoIFN-α2、-α3、-α4、-α8、-α9五种亚型在诱导6hr/24hr后得到了表达;在PRV感染的PK15细胞中,PoIFN-α2、-α3、-α8、-α9、-α10、-α13六种亚型的表达出现上调;在SFV弱毒株感染的PK15细胞中PoIFN-α2、-α3、-α4、-α8、-α9、-α10六种亚型在诱导后得到表达。荧光定量PCR分析的结果表明,Poly IC-DEAE-dextran和PRV诱导的PK15细胞中PoIFN-α的表达上调存在时间依赖性,而SFV弱毒株感染的PK15细胞中PoIFN-α的表达在6hr和24hr没有明显的不同。第二章:干扰素-θ,一种哺乳动物新型干扰素基因家族性质的研究通过对家猪基因组测序计划提交的工作草图序列进行生物信息学分析,我们发现了一组干扰素基因近似序列。该组基因编码的蛋白质与其他I型干扰素存在23%-59%的氨基酸序列同源性,SMART软件预测发现其具有I型干扰素的保守结构域,同时进化分析表明该基因家族与小鼠的IFN-ζ基因及家猪的IFN-δ具有较近的系统发生关系,综合以上几点我们认为该组基因是一个新型的I型干扰素基因家族,命名为IFN-θ。IFN-θ基因家族由8个亚型组成,其中有5个亚型编码具有生物功能的蛋白质,而其他3个亚型为假基因。在5个功能亚型中,IFN-θ2与IFN-θ3、IFN-θ4与IFN-θ5分别具有很高的序列同源性,而IFN-θ1与其他4个亚型均有80%左右同源性。我们根据基因组分析得到的序列设计引物并以家猪肝脏基因组DNA为模板,利用PCR的方法分离到了5条IFN-θ功能基因。将IFN-θ的三种亚型（IFN-θ1、IFN-θ2、IFN-θ5）克隆入真核表达载体并转染细胞,经过48小时表达后收集上清液,生物活性分析表明IFN-θ的三种亚型在PK-15细胞和IBRS-2细胞中均有抗病毒功能,但是三个亚型的抗病毒活性明显不同。在病毒诱导表达谱分析中,PRV、SFV减毒株及Poly IC均能够在不同时间点在IBRS-2细胞中诱导IFN-θmRNA的表达。受体结合分析及IFN-θ诱导ISGs基因分析表明,IFN-θ分子能与IFNαR胞外区发生特异性结合反应,激活下游JAK/STAT信号通路,产生ISGF3聚合物并与ISRE结合,最终引起ISGs基因的上调表达。最后我们分析了IFN-θ对其他细胞因子的影响,实验结果表明IFN-θ能够使IL-6、IL-12及IFN-γ三种细胞因子的表达上调,说明IFN-θ对免疫系统存在潜在的调节作用。综上所述,IFN-θ不仅在序列上与其他I型干扰素有较高的同源性,在抗病毒、受体结合、诱导表达等多个方面符合I型干扰素的共同特征,因此我们认为IFN-θ是I型干扰素基因家族中一个新的亚型。第三章:猪干扰素-alpha用作抗口蹄疫病毒重组多肽疫苗佐剂的研究在本项研究中,我们将猪干扰素-alpha（PoIFN-α）制备的核酸佐剂与抗口蹄疫基因工程多肽疫苗联合免疫动物,检测猪干扰素-alpha在动物体内的佐剂效果。首先,将PoIFN-α基因克隆入pcDNA3真核表达载体中,筛选阳性克隆后大量抽提质粒,通过脱水化-再水化步骤将重组质粒包裹入阳离子脂质体内制备成核酸佐剂（IFN-adjuvant）。该佐剂与低剂量的多肽疫苗联合注射家猪。检测结果表明,佐剂与疫苗联用可以强烈地诱导动物体产生FMDV中和抗体和T细胞介导的免疫反应;然而在只注射低剂量的多肽疫苗的动物体内,我们只检测到温和的细胞免疫和体液免疫反应。作为蛋白疫苗的佐剂,PoIFN-α能够诱导炎症因子（inflammatory cytokine）在动物体内的强烈表达,这个结果表明干扰素佐剂和多肽疫苗能够使原T辅助细胞向I型辅助细胞（Th1）分化。对动物体内PoIFN-α含量测定结果表明,重组蛋白疫苗能够与干扰素佐剂协同反应产生内源性IFN-α的表达。在病毒攻击实验中,所有的对照组动物均出现口蹄疫临床症状;然而佐剂和疫苗联合注射组的动物均得到保护,没有发现病毒血症和口蹄部水疱,对该组的病毒非结构蛋白抗体检测表明,攻毒14天后没有发现病毒在动物体内复制。根据以上结果,我们认为猪干扰素-alpha是抗口蹄疫病毒多肽重组疫苗的高效佐剂,能够有效的辅助多肽疫苗提高动物体内的免疫反应并保护动物免受口蹄疫病毒的感染。
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