抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研制

论文摘要

小鹅瘟是由细小病毒科、依赖病毒属中的鹅细小病毒引起的一种高度接触性和败血性传染病,主要侵害4～20日龄内的雏鹅和雏番鸭,引起急性肠炎及肝脏、肾脏、心脏等实质脏器败血性病变,尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征,发病率和死亡率可高达90%以上。目前,此病每年都有不同程度的流行,是养鹅及番鸭地区最主要的传染病之一,造成严重的经济损失。因该病主要感染雏鹅和雏番鸭,所以,该病的早期诊断显得极为重要。本试验用GPV南京分离株（NJ株）接种非免疫鹅胚,将收获的病毒尿囊液与等量氯仿混合,除去杂蛋白,加入氯化钠使其浓度达到2.2%,用终浓度6%PEG-6000将绝大部分病毒沉降下来,通过蔗糖密度梯度超速离心对病毒进行纯化。经PCR检测及电镜观察,发现病毒主要分布在35%～50%蔗糖浓度之间,病毒的蛋白含量为216μg/ml,SDS-PAGE电泳分析,证明病毒的纯度达到90%以上,达到实验要求。将提纯浓缩后的小鹅瘟病毒用甲醛灭活,免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E12/2H11和3F1。腹水效价分别为1：32000、1：80000和1：16000;间接免疫荧光试验证明该三株单抗均有良好的特异性；western blot证明这三株单抗均针对鹅细小病毒结构蛋白VP3。选取效价高的单克隆抗体2H11进行纯化,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的兔抗小鹅瘟多抗固定于硝酸纤维素膜（NC）上作为捕获抗体,制作成双抗夹心法GPV胶体金免疫层析试纸条。用该试纸条可特异性检测小鹅瘟病毒,在10～15min内可得到检测结果,敏感度为104.1GELD50/0.2ml。该试纸条特异性高,重复性好,可用于GP的临床快速诊断。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一篇 文献综述
• 第一章 小鹅瘟病毒的研究进展
• 1 小鹅瘟概述
• 1.1 GP流行病学
• 1.2 致病机理
• 1.3 临诊症状
• 1.4 病理变化
• 1.5 组织学变化
• 2 小鹅瘟病毒病原学研究进展
• 2.1 GPV的分类地位
• 2.2 GPV的形态特征和理化特性
• 2.3 GPV的宿主范围和培养特性
• 3 小鹅瘟病毒的分子生物学研究进展
• 3.1 GPV基因组的结构特点
• 3.2 GPV基因组的转录和复制
• 3.3 GPV病毒基因编码的蛋白
• 4 小鹅瘟病毒的诊断与防治
• 4.1 小鹅瘟病毒实验室诊断技术的研究进展
• 4.2 小鹅瘟的防治
• 5 小鹅瘟病毒抗原表位的研究进展
• 6 单克隆抗体技术在小鹅瘟病毒方面的研究进展
• 7 免疫胶体金标记技术在小鹅瘟病毒方面的研究进展
• 8 研究目的和意义
• 参考文献
• 第二篇 实验部分
• 第二章 小鹅瘟病毒的纯化
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物
• 1.3 试验用主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 小鹅瘟病毒的增殖
• 2.2 病毒的纯化
• 2.3 纯化后鹅细小病毒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 病毒的PCR鉴定
• 3.2 电镜观察
• 3.3 SDS-PAGE
• 4 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 第三章 小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验动物及细胞株
• 1.3 试验用主要试剂
• 1.4 主要仪器与耗材
• 2 方法
• 2.1 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2 单克隆抗体的大量制备
• 2.3 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性
• 2.4 单克隆抗体的特性鉴定
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 ELISA检测方法最适工作条件的确定
• 3.3 腹水纯化
• 3.4 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性
• 3.5 单克隆抗体的特性鉴定
• 3.6 单克隆抗体特异性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 ELISA筛选方法的建立
• 4.2 关于细胞融合
• 4.3 杂交瘤细胞株的克隆
• 参考文献
• Abstract
• 第四章 小鹅瘟病毒单克隆抗体胶体金免疫层析试纸条的研制
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试纸条材料
• 2 方法
• 2.1 单克隆抗体的制备
• 2.2 器材处理及所需溶液的配制
• 2.3 免疫胶体金的制备
• 2.4 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 2.5 胶体金免疫层析检测试纸条成品检验
• 3 结果
• 3.1 兔抗小鹅瘟病毒血清的纯化
• 3.2 胶体金标记抗体最适pH值的确定
• 3.3 胶体金标记抗体最适蛋白浓度的确定
• 3.4 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 3.5 胶体金免疫层析检测试纸条成品检验
• 4 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文总结
• 附录
• 致谢