美味牛肝菌多糖高产菌株的选育及其发酵工艺研究

论文摘要

美味牛肝菌属外生菌根菌,其多糖具有明显的抗肿瘤效果。为了选育出美味牛肝菌多糖高产菌株,本实验首次采用原生质体紫外线-氯化锂（UV-LiCl）复合诱变方法,并对诱变株（UL-7）发酵工艺进行了研究。本实验主要研究结果如下:1、首先摸索出美味牛肝菌出发菌株ACCC50559快速生长的斜面培养基,并优化出美味牛肝菌多糖的提取工艺和含量测定方法。在此基础之上,进行了出发菌株ACCC50559原生质体UV-LiCl复合诱变选育多糖高产菌株的研究,确定了原生质体制备和复合诱变的最佳条件。原生质体制备最佳条件为:培养52h的菌丝用0.02g/mL纤维素酶和0.02g/mL蜗牛酶（体积比1:1）混合酶液酶解,以0.6mol/L的甘露醇作为稳渗剂,在25～29℃下酶解2h,原生质体的数目可达3.50×106个/mL,其再生率为7.14%;原生质体UV-LiCl复合诱变的最佳条件为:距15W紫外灯30cm处,照射原生质体6min,然后涂布在0.04%LiCl平板上,避光培养10d,致死率达到79.6%。对诱变菌株进行平板培养和发酵试验,通过初筛和复筛最终选育出遗传性状稳定的多糖高产菌株（UL-7）,其菌落密度和菌丝生长长势较出发菌株要密和粗壮,生长速度快,产量为3.972g.L-1,较出发菌株提高了41.9%;2、优化出诱变株UL-7液体发酵的最佳工艺条件。液体发酵产多糖的最适培养基配方（%）:蔗糖2,蛋白胨0.6,ZnSO4·7H2O 0.10,CaCO3 0.1, MgSO4·7H2O 0.2, KH2PO4 0.3,马铃薯10;液体发酵产多糖的最适发酵条件:初始pH 5.0～5.4,振荡速度120r/min,培养温度25℃～28℃,装液系数40%（v/v）,加玻璃珠10颗,发酵时间5d,多糖产量可达到4.361g/L;3、在诱变株UL-7最佳液体发酵条件基础上,首次探索出其高密度发酵高产多糖的工艺:接种生物量40g/L,初始pH5.4,培养温度25℃,装液系数40%（v/v）,振荡速度160r/min,蛋白胨增加到1.8%,碳氮比（C/N）为6:1,羧甲基纤维素（CMC）浓度为0.5%,维生素B1浓度为40mg/L,三十烷醇的最佳用量为0.8×10-6mg/L,发酵时间5d,多糖产量可达到9.840g/L。通过10L机械搅拌罐放大培养,发酵时间缩短为96h,多糖产量高达9.930g/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 概述
• 1.1 美味牛肝菌及多糖研究概况
• 1.2 原生质体诱变育种技术
• 1.3 高细胞密度发酵技术
• 1.4 本课题研究的意义和内容
• 第2章 美味牛肝菌母种培养基的筛选优化实验
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基配方
• 2.2 实验方法与内容
• 2.2.1 菌株的活化
• 2.2.2 菌丝生物量的测定
• 2.2.3 美味牛肝菌菌丝体生长曲线的测定
• 2.2.4 培养基成分筛选优化实验
• 2.2.5 培养基成分正交优化实验
• 2.3 结果分析与讨论
• 2.3.1 美味牛肝菌菌丝体生长曲线测定结果
• 2.3.2 不同碳源对美味牛肝菌菌丝体生长的影响测定结果
• 2.3.3 不同氮源对美味牛肝菌菌丝体生长的影响测定结果
• 2.3.4 不同无机盐对美味牛肝菌菌丝体生长的影响测定结果
• 2.3.5 培养基成分正交优化实验测定结果
• 2.4 本章小结
• 第3章 美味牛肝菌多糖提取工艺及测定方法的研究
• 3.1 美味牛肝菌多糖的提取工艺
• 3.1.1 多糖提取工艺流程
• 3.1.2 多糖提取与脱蛋白方法的研究
• 3.2 美味牛肝菌多糖含量测定方法的确定
• 3.2.1 最大吸收光波长的测定
• 3.2.2 最佳显色温度的测定
• 3.2.3 最佳显色时间的测定
• 3.2.4 稳定性实验的测定
• 3.2.5 标准曲线的测定
• 3.2.6 样品回收率的测定
• 3.3 结果分析与讨论
• 3.3.1 多糖提取实验结果
• 3.3.2 脱蛋白实验结果分析与讨论
• 3.4 本章小结
• 第4章 原生质体UV-LiCl复合诱变选育多糖高产菌株
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基配方
• 4.1.3 试剂配制
• 4.2 实验方法与内容
• 4.2.1 菌株的活化培养
• 4.2.2 原生质体制备的方法
• 4.2.3 原生质体产率影响实验
• 4.2.4 原生质体的再生
• 4.2.5 UV-LiC1 复合诱变育种
• 4.2.6 分析方法
• 4.3 结果分析与讨论
• 4.3.1 原生质体产率影响实验结果
• 4.3.2 原生质体的再生
• 4.3.3 UV-LiCl 复合诱变育种
• 4.4 本章小结
• 第5章 诱变株UL-7 液体发酵工艺优化实验
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基配方
• 5.2 实验方法与内容
• 5.2.1 分析方法
• 5.2.2 诱变菌株UL-7 液体发酵产多糖培养基优化实验
• 5.2.3 诱变菌株UL-7 液体发酵产多糖发酵条件优化实验
• 5.3 结果分析与讨论
• 5.3.1 诱变菌株UL-7 液体发酵产多糖培养基优化实验结果
• 5.3.2 诱变菌株UL-7 液体发酵产多糖条件优化实验结果
• 5.4 本章小结
• 第6章 诱变株UL-7 高密度发酵产多糖工艺的研究
• 6.1 材料与仪器设备
• 6.1.1 菌种
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 仪器设备
• 6.2 实验方法与内容
• 6.2.1 菌株的活化及液体种子的制备
• 6.2.2 10L 机械搅拌发酵罐的灭菌与接种
• 6.2.3 菌丝生物量的测定
• 6.2.4 多糖的提取
• 6.2.5 多糖的测定
• 6.2.6 诱变株UL-7 高密度发酵工艺实验
• 6.2.7 10L 机械搅拌发酵罐高密度发酵放大实验
• 6.3 结果分析与讨论
• 6.3.1 诱变株UL-7 高密度发酵工艺实验测定结果
• 6.3.2 10L 机械搅拌发酵罐高密度发酵放大实验结果
• 6.4 本章小结
• 第7章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 攻读硕士学位期间参加的科研项目