论文摘要
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种慢性、异质性、系统性的自身免疫性疾病。其主要特征是关节软骨和骨质的进行性破坏,并伴有免疫功能的紊乱。巨噬细胞在炎症反应过程起着十分重要的作用。在局部或全身炎症反应过程中,巨噬细胞活化,其功能发生改变,同时产生许多炎症介质,其中包括TNF-α、IL-1、PGE2、IL-6等。鸟苷酸结合蛋白（Guanine nucleotide- binding proteins, G-protein）,简称G蛋白,其介导的信号转导通路在炎症免疫性疾病中发挥重要作用。细胞因子、神经递质、激素、磷脂、光刺激、嗅觉及味觉特异性配基和丝裂原均可通过跨膜的G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors,GPCRs）引发G蛋白活化及其下游信号传递。佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）模型大鼠腹腔巨噬细胞功能的异常改变可能与G蛋白-cAMP信号转导通路的异常改变有关。本研究在建立大鼠AA模型的基础上,研究从安徽道地药材木瓜中制取的有效部位木瓜苷（glucosides of chaenomeles speciosa,GCS）和白芍总苷的主要成分芍药苷（paeoniflorin,PF）对AA大鼠腹腔巨噬细胞异常功能变化及其部分作用机制,为进一步筛选高选择性的RA有效治疗药物、开发和利用中药及天然药物资源提供理论依据。目的:研究GCS和PF对AA大鼠继发性炎症反应的治疗作用;以腹腔巨噬细胞为突破口,阐明大鼠AA状态下腹腔巨噬细胞功能异常变化并明确GCS和PF在这方面的作用。方法:大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂（Freund’s completed Adjuvant, FCA）,诱发大鼠AA模型,以GCS30、60、120mg?kg-1（ig,d17d24）治疗给药,PF25、50、100 mg?kg-1（ig,d17d24）、雷公藤多苷（glucosides of tripterygium wifordii,GTW）作阳性对照40 mg?kg-1（ig,d17d24）。足容积法测量大鼠继发侧足爪肿胀度（△ml）。吞噬功能采用中性红法测定,白细胞介素-1（interleukin-1, IL-1）活性的测定采用小鼠胸腺细胞增殖法,肿瘤坏死因子α（tumor necrosis Factor alpha, TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）和环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）含量的测定采用放射免疫测定法,Western blot检测腹腔巨噬细胞中G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinases, GRK2）、视紫红质抑制蛋白（arrestin）中的β-arrestin1、前列腺素E2受体（E-prostanoid, EP2）的表达水平。结果:1. GCS和PF对大鼠AA具有治疗作用应用FCA诱导大鼠AA模型,其继发性反应表现为以多发性关节炎为特征的关节肿胀和触痛、消瘦、活动障碍等类似RA的症状。AA模型组在致炎后d17、d21、d24继发侧足肿胀度与正常组比较明显增加。GCS30、60、120mg?kg-1（ig,d17d24）和PF25、50、100 mg?kg-1（ig,d17d24）体内给药可不同程度明显减轻AA大鼠的继发性足肿胀。表明GCS和PF对大鼠AA具有治疗作用。2.改善AA大鼠腹腔巨噬细胞异常吞噬功能是治疗大鼠AA的重要作用环节AA模型组腹腔巨噬细胞吞噬中性红的量明显高于正常组。同时,GCS60,120mg·kg-1（ig,d17d24）和PF25、50、100 mg?kg-1（ig,d17d24）能明显抑制腹腔巨噬细胞过强的吞噬功能。表明GCS和PF均可通过改善AA大鼠异常吞噬功能从而发挥其治疗作用。AA大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1、TNF-α、PGE2的生成明显高于正常组。GCS（30mg·kg-1）与AA组比较,对IL-1及TNF-α的生成,没有明显改变;对PGE2的生成有显著性改变。GCS60,120mg·kg-1可明显抑制PMф中IL-l、TNF-α、PGE2的生成。PF25mg·kg-1与AA组比较,对IL-1、TNF-α及PGE2的生成,均没有显著性差异。PF50,100mg·kg-1可明显抑制PMф中IL-l、TNF-α、PGE2的生成。对AA大鼠腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1、TNF-α及PGE2水平有抑制作用,表明GCS和PF可能通过直接作用或抑制腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节AA大鼠免疫功能是其发挥作用的重要途径之一。3. GCS和PF影响AA大鼠滑膜细胞G蛋白-AC-cAMP信号转导通路GCS60,120 mg·kg-1和PF25、50,100 mg·kg-1显著提高腹腔巨噬细胞cAMP水平。GCS和PF对腹腔巨噬细胞cAMP水平的影响提示G蛋白-AC-cAMP信号转导通路可能参与其过程。为了进一步探讨GCS和PF影响AA大鼠腹腔巨噬细胞G蛋白水平与升高cAMP含量之间的关系,对GCS 30,60,120 mg·kg-1和PF25,50,100 mg·kg-1治疗给药（ig,d 17d24）后大鼠腹腔巨噬细胞EP2、GRK2、β-arrestin1蛋白表达水平进行检测,结果表明,AA大鼠腹腔巨噬细胞中EP2和β-arrestin1表达较正常组大鼠升高,GRK2表达较正常组均无明显差异。而GCS （60,120 mg·kg-1）可不同程度地下调EP2和β-arrestin1的表达;PF（25,50,100 mg·kg-1）可明显下调β-arrestin1的表达;对EP2的表达有下调的趋势,但不显著。提示:G蛋白-AC-cAMP信号转导通路介导了大鼠AA的发病过程,降低EP2受体的表达、调节GRK2/β-arrestin1的平衡、影响AA大鼠腹腔巨噬细胞PGE2-EP-G蛋白-cAMP信号的正常转导可能是GCS和PF发挥治疗作用的机制之一。结论:1. GCS和PF对大鼠AA关节局部肿胀具有明显的治疗作用,改善其异常的吞噬功能是发挥作用的重要途径之一。2. GCS和PF不同程度上均可抑制AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-l、TNF-α、PGE2水平。3. GCS和PF不同程度下调AA大鼠腹腔巨噬细胞中β-arrestin1和EP2的蛋白表达,促进cAMP生成增加,影响了G蛋白-AC-cAMP信号转导通路,这可能是GCS和PF治疗大鼠AA的另一机制。