SD大鼠视杆双极细胞L—钙通道电流特点

论文摘要

双极细胞是脊椎动物视网膜的谷氨酸中间神经元,它接受光感受器细胞的信号输入,在整合后传递至无长突细胞和神经节细胞。而在视网膜的信号传递中,双极细胞的突触前终末还受到无长突细胞的负反馈抑制,影响其对下一级神经节细胞的递质分泌,因此双极细胞在视网膜信号传递的过程处于一个关键的位置。双极细胞通过其形态和生理方面的特征被分为视杆双极细胞和视锥双极细胞,其中大鼠视杆双极细胞在形态上特征明显,易于辨认,而视锥双极细胞则形态多样,目前根据形态学分为9种类型。由于Ca2+流入细胞对于神经递质出胞有重要作用,很多学者致力于神经元上Ca2+通道的特点,研究发现大鼠视网膜视杆双极细胞释放的神经递质的基础是L型Ca2+通道介导的Ca2+电流,因此L-Ca2+通道的功能失调则会影响视杆双极细胞的神经传导。我实验室在实验中发现两种自发性突变大鼠,分别为先天性静止性夜盲（congenital stationary night blindness CSNB）和视网膜锥体细胞失功能（retinal cone degeneration RCD）。目前已知前者的致病基因为cacna1f,该基因为一种L型钙通道基因,该通道蛋白位于视杆细胞突触后膜上,调节视杆细胞。通过调节细胞内Ca2+浓度而影响视杆细胞突触递质的释放。探索相关的研究方法,了解正常大鼠L型Ca2+通道的性质,对于研究我们实验室两种模式动物的视网膜神经传导通路特点有着重要的意义。为开展相关研究,本文先后采用了木瓜蛋白酶急性分解和视网膜铺片后切片两种方法进行视杆双极细胞的钙通道电流的记录。材料与方法选取4-7周的SD大鼠。（1）使用木瓜蛋白酶急性分解的方法中,采用木瓜蛋白酶（papain,30,000USP u/mg,Calbiochem-Novabiochem）酶解获得视杆双极细胞,使用倒置显微镜、EPC10（Heka,Germany）及配套软件Pulse 8.6（Heka,Germany）来观察细胞及膜片钳记录。（2）在使用视网膜铺片后切片的方法中,使用手动切片机（ST-20, Narishige, Tokyo, Japan）迅速将视网膜切成150微米的薄片。然后使用EPC10（Heka,Germany）配套软件Pulse 8.6（Heka,Germany）来进行观察细胞及膜片钳记录。结果1.在木瓜蛋白酶急性分解的方法中,可以观察到形态正常,数量较多的视杆双极细胞。但是在记录过程中,除一例细胞外,其余细胞均记录不出L-Ca2+通道电流,但是可以正常记录出GABA受体介导的电流。2.在使用视网膜铺片后切片的方法中,可以观察到清晰的视网膜神经细胞层次,辨别出视杆双极细胞,并且在记录过程中,在视杆双极细胞的胞体成功记录出L-Ca2+通道电流。在实验中,慢电容补偿（slow capacitance）值为3.2±0.3pF（n=11）。阶越（step）刺激:大小为31.1±3.3 pA（n=11）。斜坡（ramp）刺激:大小为32.5±3.1pA（n=11）。3.在得到稳定的Ca2+电流之后,给予L-Ca2+通道阻断剂nifedipine,浓度5μM,几乎完全阻断Ca2+电流。结论1.木瓜蛋白酶急性分离的方法,未能记录出L-Ca2+通道电流。可能由于视杆双极细胞轴突损伤,从而导致无法记录出L-Ca2+通道电流。2.视网膜铺片后切片的方法,根据实验得到的数据,得到的电流,其电流的大小和性质符合L-Ca2+通道电流的特点。通过相关药物可阻断视杆双极细胞L-Ca2+通道的信号传导。在本次实验中使用nifedipine,可以有效阻断L-Ca2+通道的电流。实验所得到的结果亦与国外相关文献报道的正常大鼠视网膜双极细胞L-Ca2+通道电流结果基本相符。因此,可以判断,在此次实验中,记录得出的电流即为L-Ca2+通道电流。采用此种方法进行全细胞膜片钳研究是可行的。为我们进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 1 视网膜的基本结构及功能
• 2 视网膜双极细胞的功能
• 2.1 视网膜双极细胞上的谷氨酸受体
• 2.2 双极细胞的突触传递
• 3 视网膜双极细胞的分类
• 3.1 ON型和OFF 型双极细胞的鉴别
• 3.2 视杆双极细胞与视锥双极细胞的特点
• 4. 视杆双极细胞的特性
• 5 钙通道
• 5.1 钙离子通道结构
• 5.2 钙通道的分类
• 5.3 钙通道的功能和钙拮抗剂
• 正文
• 实验一急性分离获得视杆双极细胞及通道记录
• 1 引言
• 2 实验材料
• 2.1 实验对象
• 2.2 实验标本的制备
• 2.3 溶液与药品
• 3 方法
• 3.1 电极的制备
• 3.2 膜片钳实验装置
• 3.3 GABA受体介导电流的施药系统
• 3.4 数据处理
• 4 结果
• 4.1 分离的大鼠Rod-BC形态鉴定
• 4.2 分离的大鼠Rod-BC离子通道的记录
• 5 讨论
• 实验二SD大鼠视网膜切片上视杆双极细胞的L型钙通道的记录
• 1 引言
• 2 实验材料
• 2.1 实验对象
• 2.2 实验标本的制备
• 2.3 溶液与药品
• 3. 方法
• 3.1 电极的制备
• 3.2 膜片钳实验装置
• 3.3 数据处理
• 4 结果
• 4.1 视杆双极细胞的鉴别
• 4.2 视杆双极细胞L型钙通道记录
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢