奶牛Cathelicidins抗菌肽Bac5基因的克隆、表达及抑菌活性分析

论文摘要

近年来,由于长期乱用和滥用抗微生物药物,使耐药性问题日益严重,增加了动物疾病的防治难度,同时引起了动物产品抗生素残留,严重影响了动物性食品安全。因此,研究和开发新型安全、有效和环保的抗菌药物已迫在眉睫。抗菌肽广泛存在于动植物体内,在机体的先天性免疫和获得性免疫中发挥着重要作用,加之对耐药菌株强大的抗菌作用而倍受关注。牛Bac5是一种具有延伸螺旋结构的强效阳离子抗菌多肽,属于Cathelicidins抗菌肽,在牛机体抵抗外来病原体入侵方面具有重要作用。传统的从牛机体组织中提取Bac5的方法具有操作复杂、成本高、产量低、不能规模化生产等缺点。因此,借助于基因工程技术来获取Bac5重组蛋白有望解决该难题,并已成为开发新型环保抗菌制剂的新的发展方向。本研究依据GeneBank中收录的牛Bac5基因序列设计并合成1对特异性引物,采用RT-PCR技术从荷斯坦小公牛骨髓总RNA中成功扩增出去信号肽的Bac5基因片段,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后定向亚克隆至pET28a原核表达载体中,构建pET28a-Bac5重组表达质粒,再将重组质粒转化至E.coli DH5α。在含卡那霉素（50μg/mL）的LB培养基中筛选阳性克隆,经PCR扩增、双酶切及序列测定后,将重组表达质粒pET28a-Bac5转化至E.coli Rosetta,筛选阳性克隆,并再次进行PCR和测序鉴定,将鉴定为阳性的菌液以IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定诱导表达产物,并利用大肠杆菌O111（CVCC1450）和金黄色葡萄球菌（CVCC545） 2种标准菌株和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌3种乳房炎乳常见分离菌株对表达的Bac5重组蛋白进行抑菌活性的初步鉴定。结果表明,本研究从牛骨髓中成功扩增出目的片段,并成功构建了pET28a-Bac5重组表达质粒,测序结果显示插入的目标基因片段大小为414bp,编码137个氨基酸残基,与GeneBank中收录的牛Bac5基因序列（L02650.1）的同源性为100%,且开放阅读框正确。经IPTG诱导后得以表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,分子量约为19 KD,与理论预测大小一致。抑菌试验结果表明,乳房炎乳3种常见分离菌株对青霉素、链霉素具有一定的耐药性,而对Bac5重组蛋白较为敏感;Bac5重组蛋白对2种标准菌株均表现出较强的抑菌活性。本研究为奶牛乳房炎的临床治疗和新型环保抗菌制剂的研制及开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述哺乳动物Cathelicidins 抗菌肽的研究进展
• 1 Cathelicidins 抗菌肽基因组成及前体肽结构
• 2 Cathelicidins 抗菌肽的分类
• 3 Cathelicidins 抗菌肽的合成与分布
• 4 Cathelicidins 抗菌肽的生物学作用
• 4.1 抵抗病原微生物
• 4.2 促进创伤修复
• 4.3 促进血管生成
• 4.4 趋化作用
• 4.5 抑制组织损伤
• 4.6 结合内毒素
• 4.7 细胞溶解效应
• 5 牛内源性Cathelicidins 抗菌肽
• 5.1 BMAPs
• 5.2 Bac5 和Bac7
• 5.3 Indolicidin
• 5.4 Dodecapeptide
• 6 小结
• 第二部分 实验研究牛Bac5 抗菌肽基因的克隆、表达及鉴定
• 前言
• 1 材料
• 1.1 牛股骨
• 1.2 载体与菌株
• 1.3 工具酶与生化试剂
• 1.4 常规试剂
• 1.5 仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 牛骨髓的采集
• 2.2 总RNA 的提取
• 2.3 提取的总RNA 的检测
• 2.4 引物的设计与合成
• 2.5 RT-PCR 扩增目的片段
• 2.6 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物
• 2.7 RT-PCR 产物的回收与纯化
• 2.8 重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.8.1 PET-28a 表达载体和目的片段的双酶切
• 2.8.2 双酶切产物的回收与纯化
• 2.8.3 连接反应
• 2.8.4 感受态细胞的制备
• 2.8.5 连接产物的转化
• 2.8.6 阳性克隆菌的PCR 鉴定
• 2.8.7 重组质粒的双酶切鉴定
• 2.8.8 重组质粒的测序鉴定
• 2.9 目的片段的序列分析及其编码蛋白质的结构预测
• 2.10 重组表达质粒转化E.coli Rosetta 感受态细胞
• 2.11 重组表达菌的测序鉴定
• 2.12 重组蛋白的原核表达
• 2.12.1 重组蛋白的诱导表达
• 2.12.2 SDS-PAGE 鉴定表达产物
• 2.13 重组蛋白浓度的测定
• 2.13.1 诱导菌液的处理
• 2.13.2 菌体蛋白浓度的测定
• 2.13.3 重组蛋白浓度的计算
• 2.14 重组蛋白抑菌活性鉴定
• 3 结果
• 3.1 总RNA 提取
• 3.2 RT-PCR 扩增目的片段
• 3.3 pET28a-Bac5 重组表达质粒的构建
• 3.4 pET28a-Bac5 重组表达质粒的测序鉴定及序列分析
• 3.5 Bac5 抗菌肽物化特性分析
• 3.6 Bac5 分子的结构预测
• 3.7 表达产物的SDS-PAGE 鉴定
• 3.8 Bradford 法标准曲线绘制
• 3.9 抑菌实验结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录一 GeneBank 收录牛的Bac5 前体肽基因序列
• 附录二 测序报告
• 附录三 奶牛Bac5 基因的碱基序列及推导出的氨基酸序列
• 附录四 pET28a 原核表达载体结构图
• 附录五 pET28a-Bac5 重组表达质粒构建模式图
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介