慢病毒介导中国人产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究

论文摘要

第一部分：中国人产甲酸草酸杆菌中甲酰辅酶A转移酶基因FRC和草酰辅酶A脱羧酶基因OXC慢病毒过表达载体的构建及慢病毒制备目的：产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter fomigenes, Ox.F）是一种能降解草酸的肠道厌氧菌,其中降解草酸的关键酶是甲酰辅酶A转移酶（Formyl-CoA transferase, FCoAT）和草酰辅酶脱羧酶（Oxalyl-CoA Decarboxylase, OcoAD）。从中国人肠道产甲酸草酸杆菌Ox.F中克隆编码FCoAT的FRC基因和OCoAD的OXC基因,并将FRC基因和OXC基因分别与过表达慢病毒载体重组,制备能表达FCoAT和FCoAT的慢病毒,为下一步转染肝干细胞治疗高草酸尿症奠定基础。方法：用细菌基因组提取试剂盒提取中国人Ox.F的基因组DNA作为模板,用Taq高保真DNA聚合酶分别扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收扩增片段,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接,分别获得FRC基因和OXC基因的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并进行测序,筛选出携带完整目的基因的质粒pMD18T simple- FRC和pMD18T simple-OXC,质粒提取,用BamHⅠ限制性内切酶分别对pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC进行酶切获得目的基因,连接目的基因片段FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-EGFP,连接基因片段OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,质粒小量提取并测序鉴定。重组慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装收集并测定慢病毒滴度。结果：PCR扩增分别获得含有大小约为1.3 kb和1.7 kb的DNA片段,大小与Genebank中FRC和OXC基因序列相符。测序鉴定证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有正向的FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24小时后,在荧光显微镜下分别可见大量绿色荧光和红色荧光,病毒滴度分别为1.15×108TU/ml和9.75×107TU/ml。结论：成功构建表达中国人肠道产甲酸草酸杆菌FCoAT基因FRC的慢病毒载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和OcoAD基因OXC的慢病毒pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,并制备了高滴度的过表达慢病毒载体。第二部分：胚胎来源大鼠肝干细胞的分离培养鉴定及绿色荧光转染目的：研究大鼠胚胎来源的肝干细胞分离培养鉴定,将绿色荧光蛋白转入原代肝干细胞为后续转基因肝干细胞移植动物实验提供示踪条件。方法：体外联合机械分离和胶原酶消化法分离孕13.5 d SD大鼠胚胎来源肝干细胞,随后通过半量换液法纯化细胞,采用间接免疫荧光法、Real—time PCR和Western Blot对培养原代5天的细胞进行鉴定,应用特异性培养基培养传代纯化的细胞。利用电转染技术将绿色荧光蛋白转入传至第三代的细胞。结果：原代培养的胎肝干细胞24 h后显微镜下可见细胞半贴壁状态,形态大致相同,呈圆形或卵圆形；第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形；培养第3天出现一些由3、5个形态一致的细胞集落,细胞直径6～10μm；细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚；第8天后细胞呈上皮样铺展；第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢；传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状。通过间接免疫荧光法和Western Blot从蛋白水平检测出纯化细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19, Real-time PCR检测出甲胎蛋白AFP和白蛋白ALB在基因水平表达,可认为分离纯化细胞为肝干细胞；绿色荧光能在电转后的肝干细胞中稳定表达。结论：联合机械分离法和酶消化法分离纯化出孕鼠胎肝干细胞是一种简单、经济、有效的方法,稳定表达绿色荧光的肝干细胞为下一步草酸分解基因转染的肝干细胞移植治疗PH提供相应基础。第三部分：慢病毒介导甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因转染肝干细胞的实验研究目的：观察甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因慢病毒表达载体转染后的肝干细胞的目的基因表达情况和草酸分解功能分析。方法：用前期构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染分离纯化的肝干细胞,然后流式分选,并用Real—time PCR和Western Blot检测阳性细胞中目的基因的表达情况。最后用离子色谱仪检测转染目的基因、转染空质粒后细胞对于含草酸培养液中的草酸分解功能。结果：pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED两种慢病毒过表达载体成功转染肝干细胞,分别可见绿色荧光和红色荧光,流式细胞仪分选能提高阳性表达率。Real—time PCR和Western Blot分别检测到FRC和OXC在基因水平和蛋白水平表达。离子色谱仪检测出pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP稳转的细胞培养一周后各组草酸浓度分别为空白组[（1.58±0.03）g/L]、转染空质粒细胞组[（1.57±0.01）g/L]、转染细胞组[（1.37±0.02）g/L],三组相比有统计学显著差异（P<0.01）结论：慢病毒转染草酸分解基因是肝干细胞持续获得草酸分解能力的一种有效途径,具有草酸分解功能的肝干细胞为细胞移植治疗高草酸尿奠定基础。

论文目录

• 主要缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分:中国人产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶FRC和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因慢病毒过表达载体的构建及慢病毒制备
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:胚胎来源大鼠肝干细胞的分离培养鉴定及绿色荧光转染
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分:慢病毒介导甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因转染肝干细胞的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述:原发性高草酸尿研究进展
• 参考文献
• 附录:攻读研究生期间发表的论文
• 致谢