严格调控表达HCVNS3/4A蛋白三转基因小鼠的建立

论文摘要

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝病的主要病原体，目前全球约有1.7亿HCV感染者。由于HCV的高度变异性，至今尚无特异有效的疫苗和治疗药物，因而其感染已成为全球性的严重的公共卫生问题之一。自1989年首次分离和鉴定出HCV至今，对HCV的防治研究一直进展缓慢。其原因主要是由于HCV感染高度严格的种属嗜性导致有效、稳定的实验动物模型的缺乏。这不仅严重阻碍了对HCV感染和致病机制的研究，而且也极大地限制了抗病毒药物和疫苗的开发。HCV基因组RNA编码的NS3/4A蛋白具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性。体外实验研究表明，HCV NS3/4A蛋白在蛋白前体的加工成熟、RNA复制以及病毒装配等过程中发挥着关键作用。因此，NS3/4A蛋白已成为目前抗HCV药物研发中最为重要的靶点之一。不仅如此，NS3/4A丝氨酸蛋白酶靶向作用于感染细胞内非病毒复制相关的宿主蛋白，通过阻碍干扰素合成信号的传递等介导病毒的免疫逃逸与感染慢性化。这提示，靶向NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制剂可能具备阻断感染细胞内病毒的复制和恢复感染细胞内固有免疫防御应答的双重作用。为了进一步在动物水平深入研究NS3/4A蛋白与宿主相互作用的机制及为NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选提供可靠有效的动物模型，本课题联合应用Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统，通过在体生物发光成像技术筛选和建立了稳定、可调控表达HCV NS3/4A蛋白的转基因小鼠模型，试验证实该转基因小鼠模型体内NS3/4A蛋白的表达具有良好的组织特异性和可调控性。主要内容和结果如下：1.构建受Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统双重调控表达NS3/4A蛋白的重组载体pBI-G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A采用分子克隆技术在真核表达质粒pBI-G双向启动子一侧多克隆位点处依次插入LoxP、Fluc、BGH PolyA、LoxP及NS3/4A序列，成功构建了含Tet-On调控系统元件和Cre/LoxP基因剔除系统元件、报告基因Fluc及HCVNS3/4A蛋白基因的重组质粒pBI-G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A。该重组质粒与pTet-On及pBI-G//Cre质粒共转染CHO细胞，生物发光成像及蛋白表达检测显示，当且仅当细胞经Dox持续诱导，同时表达反向四环素调控转录激活因子（rtTA）与Cre重组酶时，该重组质粒才表达NS3/4A蛋白，体外证实了该重组载体构建成功且表达NS3/4A蛋白的调控性良好。另外，在该重组质粒中报告基因Fluc的合理引入，为后期利用在体生物发光成像系统鉴定、筛选转基因小鼠奠定了基础。2. NS3/4A转基因小鼠建系，并与肝脏组成型表达rtTA的纯合型Lap转基因小鼠杂交，筛选调控表达报告基因Fluc的NS3/4A/Lap双转基因小鼠重组质粒pBI--G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A经酶切后，得到线性化的NS3/4A转基因载体，经受精卵显微注射制备获得了NS3/4A转基因首建鼠。6只首建鼠经PCR与Southern Blot鉴定后，与已稳定建系的肝脏组成型表达rtTA的纯合型Lap转基因小鼠杂交。所有子代小鼠（F1）首先通过提取基因组DNA并经PCR扩增转基因片段进行基因型的鉴定，NS3/4A转基因与Lap转基因均阳性的子代小鼠（F1）经Dox持续诱导后通过在体生物发光成像系统（in vivo Bioluminescent Imaging，BLI）检测FLuc的表达进行表型的鉴定。生物发光信号强烈的小鼠即基因型与表型一致的NS3/4A/Lap双转基因小鼠（F1），再与纯合型Lap转基因小鼠杂交，所有子代小鼠（F2）经PCR和BLI进行鉴定和筛选基因型与表型一致的NS3/4A/Lap双转基因小鼠（F2）。同法反复杂交、筛选、建系，获得了稳定遗传、高效表达FLuc的NS3/4A/Lap双转基因小鼠。Western Blot检测结果显示FLuc仅表达于经诱导后的NS3/4A/Lap双转基因小鼠肝脏组织，具有良好的特异性和调控性，为下一步筛选严格调控表达NS3/A蛋白的三转基因小鼠奠定了基础。3.将稳定建系的NS3/4A/Lap双转基因小鼠与已建立的Lap/LC-1双转基因小鼠杂交，筛选严格调控表达NS3/4A蛋白的NS3/4A/Lap/LC-1三转基因小鼠选择经鉴定的NS3/4A/Lap双转基因小鼠与Tet-On系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的Lap/LC-1双转基因小鼠交配，子代小鼠分别经基因型鉴定（PCR）、表型鉴定（BLI）后筛选获得NS3/4A/Lap/LC-1三转基因小鼠。然后通过免疫组织化学染色及Western Blot检测三转基因小鼠体内Cre重组酶、NS3/4A蛋白的表达。BLI结果显示仅在Dox持续诱导后三转基因小鼠肝脏部位检测到强烈的生物发光信号，表明三转基因小鼠肝细胞内报告基因FLuc特异高效表达；免疫组化及Western Blot结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白仅在经Dox持续诱导后的三转基因小鼠肝细胞特异性表达，与BLI鉴定结果一致。与Lap/NS3/4A双转基因小鼠在Dox持续诱导后肝脏仅特异性表达Fluc的情况不同的是，该三转基因小鼠仅在Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统同时发挥作用时肝脏特异性表达NS3/4A蛋白，表明该三转基因小鼠具有良好的特异性和调控性。综上，本研究建立了Tet-On系统和Cre/LoxP系统双重调控下表达HCVNS3/4A蛋白的三转基因小鼠模型，为进一步研究HCV NS3/4A蛋白与宿主相互作用的机制及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选和评价奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 一、HCV 细胞模型的建立及其在病毒复制周期机制研究与抗病毒药物开发中的应用
• 二、HCV 实验动物模型的开发与应用
• 三、HCV NS3/4A 蛋白结构与功能及与宿主蛋白相互作用的研究进展
• 四、在体光学成像技术及其应用
• 第一部分 构建 Tet-On 和 Cre/LoxP 系统双重调控表达 HCV NS3/4A 蛋白的真核表达载体
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二部分 NS3/4A 转基因小鼠建系和筛选调控表达 Fluc 的 NS3/4A/Lap 双转基因小鼠
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第三部分 筛选严格调控表达 NS3/4A 蛋白的 NS3/4A/Lap/LC-1 三转基因小鼠
• 1.材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 附录
• 致谢