水稻冷胁迫相关miRNA基因的预测及冷胁迫相关性验证

论文摘要

低温冷害是水稻生产的大敌,是影响水稻生长、发育和地理分布的重要环境限制因素,严重影响水稻的产量和品质。应用基因工程方法培育耐低温转基因水稻新品种是农业生产上亟待解决的重要问题;发现有效而可靠的抗冷主效基因,阐明植物抗冷的生理机制,研究抗冷反应中的基因表达方式,是目前植物基因工程研究的重点。常规的分子生物学方法通过转入功能基因来提高植物的抗性,已取得一定的效果,但存在已有的单基因难以在整体上大幅度提高抗性的问题,而多基因联合导入存在基因间的互作不好协调,且操作难度大、遗传不稳定等难题,使该方法受到了很大的限制。microRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸的内源小分子非编码RNA,它广泛地调控着真核生物的基因表达。被调控的基因涉及信号蛋白、酶类、转录因子等,涉及的生物过程主要有发育、代谢、抗逆等。有研究表明,miRNA以一种节能型的方式在表达调控中起作用,即miRNA趋向于降解/阻碍那些起正调控作用的靶基因表达,从而减少了下游大量基因的表达量,整体上减少了植物自身的负担,比常规的导入功能基因的策略更具有实用价值,如果能以有抗冷害潜力的miRNA对水稻进行遗传转化,只需转入一个基因就可经济地调控许多胁迫相关的基因表达,将有希望得到优良的耐胁迫转基因新品系。如果能找到在作物抗逆反应中起到关键作用的miRNA基因,将为植物抗逆分子育种提供一个新的策略,其科学与应用价值是巨大的。所以,为了挖掘miRNA在植物抗逆基因工程领域的应用潜力,本研究通过生物信息学方法利用miRNA数据库和miRNA靶基因预测软件预测出水稻miRNA的靶基因,再根据水稻mRNA数据库和蛋白质数据库等为依据筛选出与冷胁迫相关的靶mRNA序列,其对应的miRNA就是与水稻冷胁迫相关的miRNA。最终发掘出了在水稻抗冷胁迫中起到重要基因表达调控作用的miRNA。为今后利用miRNA序列进行水稻抗冷基因工程研究打下坚实的前期基础。本研究获得的主要研究结果如下:1.水稻miRNA靶基因的预测从miRNA数据库中提取所有已知水稻miRNA序列,通过miRNA靶基因预测软件预测出了所有miRNA的靶基因。共预测出189个miRNA的靶基因2138个。2.水稻冷胁迫相关的靶基因的筛选下载gene ontology数据库,根据冷胁迫应答机制结合参考文献,选取出冷胁迫相关的关键词检索gene ontology数据库,得到冷胁迫相关的GO term。将miRNA靶基因在Uniprot数据库中作BLASTx比对,得到对应的蛋白质,并提取出靶基因蛋白的GO term信息。对照冷胁迫相关GO term得到冷胁迫相关的miRNA靶基因。另外,一些学者的研究成果表明,CBF和F-box基因也在冷胁迫中起到关键作用。根据该理论,本研究在靶基因cDNA水平上利用关键词检索数据库的方式筛选出了与冷胁迫相关的靶基因。通过以上2种方法共获得了水稻冷胁迫相关miRNA靶基因19条。3.水稻冷胁迫相关miRNA的预测提取出全部水稻冷胁迫相关的miRNA靶基因,与之对应的miRNA基因便是冷胁迫相关miRNA基因。其中的一些miRNA基因的多条靶基因与冷胁迫相关,这些miRNA与冷胁迫关系更为密切。共得到水稻冷胁迫相关miRNA家族10个,其中与冷胁迫紧密相关的4个。4.预测miRNA与水稻冷胁迫的相关性的验证在预测的水稻冷胁迫相关miRNA中挑选2个miRNA（osa-miR393和osa-miR396c）进行表达量分析。提取不同冷处理时间的水稻幼苗RNA,反转录为cDNA,用real-time PCR的方法对osa-miR393和osa-miR396c miRNA的表达量分析。这2个miRNA基因在水稻受到冷胁迫后其表达水平有明显变化,验证了其与水稻冷胁迫耐受相关。也证明本研究用到的水稻冷胁迫相关miRNA预测策略科学、有效。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 水稻冷胁迫耐受机制的研究进展
• 1.2.2 miRNA研究进展
• 1.3 主要研究内容及技术路线
• 1.4 本研究的创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 水稻miRNA基因与cDNA序列的获得与整理
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 水稻miRNA靶基因的预测
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 水稻冷胁迫相关miRNA家族的预测
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 Real-time PCR验证预测结果
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻miRNA序列的提取
• 3.1.1 miRNA数据库的获得
• 3.1.2 水稻miRNA序列提取程序的编制
• 3.1.3 提取结果
• 3.2 水稻miRNA靶基因的预测
• 3.2.1 水稻cDNA数据库的获得
• 3.2.2 水稻miRNA靶基因的预测
• 3.2.3 预测结果的整理
• 3.3 水稻冷胁迫相关miRNA的筛选
• 3.3.1 靶基因的BLASTx比对
• 3.3.2 蛋白数据中GO注释信息的抽取
• 3.3.3 冷胁迫相关GO term的筛选
• 3.3.4 基于GO term信息冷胁迫相关靶基因筛选
• 3.3.5 基于TIGR数据库功能注释冷胁迫相关靶基因的筛选
• 3.3.6 获得水稻冷胁迫相关miRNA家族
• 3.4 水稻冷胁迫相关miRNA家族预测结果的Real-time PCR验证
• 3.4.1 用于real-time PCR验证miRNA基因的选择
• 3.4.2 osa-miR393和osa-miR396c上游顺式作用元件生物信息学分析
• 3.4.3 cDNA模板的制备
• 3.4.4 miRNA基因Real-time PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 利用生物信息学方法预测某一特定功能miRNA的可行性
• 4.2 2个miRNA基因表达量在冷胁迫后变化不大的原因
• 4.3 miRNA靶基因的功能分析
• 4.4 研究展望
• 5 结论
• 5.1 水稻miRNA序列的提取和整理
• 5.2 水稻miRNA靶基因的预测
• 5.3 基于GOterm注释信息冷胁迫相关靶基因的筛选
• 5.4 基于TIGR数据库功能注释冷胁迫相关靶基因的筛选
• 5.5 水稻冷胁迫相关miRNA基因家族的预测
• 5.6 osa-miR393和osa-miR396c与冷胁迫相关性的验证
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文