海洋细菌HZ105和ZC1产琼胶酶的研究

论文摘要

海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高值化的关键技术之一。琼胶酶（agarase）是可以将琼胶（琼脂）降解为琼胶寡糖的酶。不同聚合度的琼胶寡糖已被发现具有越来越多的生理功能活性,生产系列琼胶寡糖也成为了琼胶酶的一个主要应用。此外,琼胶酶还可以用于琼脂糖电泳中的核酸回收、制备海藻细胞原生质体、筛选信号肽序列等。目前的琼胶酶主要来自海洋细菌。本论文首先采集汕头海域表层沉积物和富含琼胶的紫菜藻体样品,从中筛选得到两株高产琼胶酶的海洋细菌HZ105和ZC1。通过对菌株的常规特性分析和分类鉴定,菌株HZ105归属于Agarivorans,命名为Agarivorans sp.HZ105。而16SrDNA序列分析结果,同时结合细胞形态、全细胞脂肪酸组分、碳源利用、部分生理生化性质、基因组GC含量等分析表明,菌株ZC1应作为标准菌株建立一个新属,其中菌株ZC1是一株代表新种的菌株。进一步研究了培养时间、培养基pH和NaCl浓度对两菌株生长和产琼胶酶的影响。其中菌株HZ105在pH7-10、NaCl浓度为1-3%范围内培养16h产琼胶酶最好,说明菌株HZ105偏好碱性环境生长,其所产琼胶酶也可能耐碱性。此外,菌株HZ105的胞外琼胶酶粗酶液在室温存放2天后还能保持90.9%的酶活力。而菌株ZC1在pH7-8、NaCl浓度为2-3%范围内产琼胶酶最好;但ZC1的营养需求比较特别,只能利用Biolog系统的GN2板95种碳源中葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精等少数碳源。不过菌株ZC1的琼胶酶不是只由琼脂诱导产生,这也是其独特之处,使运用廉价的碳源生产琼胶酶成为可能。采用从聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶回收蛋白的方法分离纯化了菌株HZ105的三个胞外琼胶酶,并通过SDS-PAGE电泳测得了其分子量54kDa、58kDa、105kDa,接着运用串联质谱技术鉴定了该三个琼胶酶,发现这三个酶均为β琼胶酶,属于糖基水解酶50家族。根据琼胶酶的串联质谱结果和Genbank中已报道的相关琼胶酶基因信息,设计引物,通过PCR技术从菌株HZ105中克隆了一段分子量约为105kDa的琼胶酶的编码基因,成熟蛋白编码序列长2931bp,将该基因序列比对NCBI的CDD保守区数据库,未搜索到保守区,说明其可能存在新的活性催化部位。将该基因与pET-32a（+）构建重组表达载体,转化大肠杆菌,初步探索了琼胶酶基因的重组表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 前言
• 1 琼胶和琼胶酶
• 2 琼胶酶的研究进展
• 2.1 琼胶酶的来源
• 2.2 天然琼胶酶的研究进展
• 2.3 琼胶酶的编码基因及其重组表达的研究进展
• 2.4 国内有关琼胶酶的研究状况
• 3 琼胶酶的应用
• 3.1 生产琼胶寡糖
• 3.2 琼胶酶在分子生物学研究中的重要应用
• 4 本文的主要研究内容和意义
• 第一章 产琼胶酶菌株的筛选和鉴定及其特性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂和培养基
• 1.2 产琼胶酶细菌的筛选
• 1.3 菌株的鉴定
• 1.4 DNS法测定琼胶酶活性
• 1.5 不同条件对菌株生长和产胞外琼胶酶的影响
• 1.6 菌株产胞外琼胶酶的特性
• 1.7 蛋白质浓度测定
• 2 结果
• 2.1 产琼胶酶菌株的筛选
• 2.2 产琼胶酶菌株的鉴定
• 2.3 不同培养条件对菌株生长和产琼胶酶的影响
• 2.4 菌株产胞外琼胶酶的特性
• 2.5 菌株ZC1与相近种属的性质比较
• 3 讨论
• 第二章 菌株HZ105琼胶酶的分离纯化和质谱鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂
• 1.2 琼胶酶的分离纯化
• 1.3 琼胶酶的质谱鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 琼胶酶的分离纯化
• 2.2 琼胶酶的质谱鉴定
• 3 讨论
• 第三章 菌株HZ105琼胶酶编码基因的克隆和表达
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂和材料
• 1.2 琼胶酶基因的克隆
• 1.3 琼胶酶基因的表达
• 2 结果
• 2.1 琼胶酶基因的克隆
• 2.2 琼胶酶基因的表达
• 3 讨论
• 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望与研究设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表论文情况
• 本人简历