猪流感噬菌体单链抗体库的构建、筛选及基因表达

论文摘要

猪流感（swine influenza, SI）是猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的一种在世界范围内分布的呼吸道疾病,可对感染畜群造成重大的经济损失,而且它还会与其它呼吸道疾病混合感染,损失更无法估量。猪还可以感染禽流感和人流感,被认为是新流感病毒的中间宿主,具有混合器作用,因此猪流感除了其重要的兽医卫生学意义外,更重要的还在于其显而易见的公共卫生学意义。目前控制这类传染病的主要措施还是免疫接种,但在畜禽传染病日益严重的今天,由于种种原因如母源抗体的干扰、病毒亚型较多且相互之间无交叉反应等,常规防疫措施有时无能为力。因此,我们可以另辟蹊径从抗病育种方面探索新的防病措施。本研究以猪流感病毒的经典亚型H1N1为对象开展研究,通过噬菌体抗体库技术筛选到抗H1N1猪流感病毒的单链抗体,同时也会得到该单链抗体菌株的基因型,为抗猪流感转基因猪的研究奠定基础。试验Ⅰ H1N1猪流感病毒的培养及培养条件的优化。利用MDCK细胞进行H1N1猪流感病毒的培养,首先通过对比MDCK细胞在不同接种量及血清浓度下的生长情况,优化MDCK细胞的培养；通过免疫荧光染色观察H1N1猪流感病毒的感染MDCK细胞状态,再通过红细胞凝血试验,对比病毒在不同血清浓度、TPCK胰酶浓度及培养时间下的血凝效价,找出H1N1猪流感病毒培养的最佳血清浓度、TPCK胰酶浓度及培养时间。结果发现：6孔板细胞接种量为5×105,培养48h可以用于免疫荧光和真核转染试验。MDCK细胞培养的最佳血清浓度为10%；H1N1猪流感病毒培养的最佳血清浓度为0%,最佳TPCK胰酶浓度为1.5μg/mL,最佳培养时间为72h。试验Ⅱ猪流感单链噬菌体抗体库的构建与筛选。H1N1猪流感病毒滴鼻免疫BALB/C小鼠,免疫效价达到要求后,提取小鼠脾总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR扩增出重链可变区VH和轻链可变区VL,再经过SOE-PCR,通过柔性多肽Linker接头（Gly4Ser）3按VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因拼接成scFv基因片段。将scFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切（sfi Ⅰ/Not Ⅰ）后连接,转化宿主菌TGl,经过辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体单链抗体库。以猪流感病毒为抗原包被96孔酶标板,经过3轮的亲和富集筛选,通过Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。成功构建出库容约为4×106cfu/mL抗猪流感的单链抗体库,并筛选出4株特异性抗猪流感的单链抗体,其中1株WJY001与H1N1猪流感病毒结合反应的特异性较高。试验Ⅲ WJY001噬菌体单链抗体的鉴定。PCR及序列分析,鉴定WJY001株scFv片段大小及基因序列是否正确。然后再通过阻断ELISA、夹心ELISA鉴定WJY001株噬菌体抗体是否能够与鼠源阳性多抗进行竞争结合猪流感病毒。最后通过真核转染、病毒阻断及免疫荧光试验,观察单链抗体能否在A549细胞内表达,是否对病毒感染细胞有阻断作用。结果发现：WJY001株噬菌体单链抗体可以与鼠源多抗竞争结合猪流感病毒,可以在A549细胞中表达并可阻断H1N1猪流感病毒感染A549细胞。试验Ⅳ WJY001菌株scFv的原核表达。PCR扩增出WJY001株的scFv片段,连接到PET28a载体上,转到BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测是否表达,再经过Western Blot和ELISA分析其免疫原性。结果发现：单链抗体主要以包涵体形式表达,大小30kD左右,经过蛋白重折叠,再经过Western Blot和ELISA分析,复性后的scFv与可与H1N1猪流感病毒发生特异性结合结合反应。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与縮略语
• 第一章 文献综述
• 1 猪流感的研究概况
• 1.1 SI的分类
• 1.2 SIV的形态结构与理化特性
• 1.3 SIV编码蛋白质及其功能
• 1.4 SI的流行情况
• 1.5 SI的公共卫生学意义
• 1.6 SI的防制
• 2 转基因动物简介
• 2.1 转基因动物的基本原理
• 2.2 转基因动物的研究进展
• 2.3 转基因动物的应用
• 3 噬菌体抗体库技术简介
• 3.1 噬菌体抗体库技术的产生及发展
• 3.2 噬菌体抗体库技术的基本原理
• 3.3 噬菌体抗体库技术的研究进展
• 4 展望
• 参考文献
• 第二章 H1N1猪流感病毒的培养及培养条件的优化
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 MDCK细胞培养条件的优化
• 2.2 免疫荧光检测病毒感染MDCK细胞
• 2.3 H1N1猪流感病毒培养条件的优化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪流感噬菌体单链抗体库的构建与筛选
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 棋盘法检测小鼠血清抗体效价结果
• 2.2 重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因片段的扩增及SCFV的组装与扩增
• 2.3 初级抗体库库容量的计算及鉴定
• 2.4 抗体基因多样性分析
• 2.5 噬菌体单链抗体库的富集筛选结果
• 2.6 PHAGE-ELISA检测结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 阳性克隆株WJY001的鉴定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 WJY001株阳性克隆活性的鉴定结果
• 2.2 WJY001株SCFV的真核表达
• 2.3 病毒阻断实验鉴定WJY001株SCFV
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 阳性克隆株WJY001的单链抗体的原核表达
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PET28A-SCFV重组质粒构建
• 2.2 单链抗体的诱导表达
• 2.3 单链抗体复性后的分析结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文