咪唑啉酮类除草剂降解菌的分离鉴定及降解特性研究

论文摘要

咪唑啉酮类除草剂是20世纪80年代美国氰胺公司发现的一类高效广谱性除草剂,其中咪唑乙烟酸（Imazethapyr）和甲氧醚草烟（Imazamox）使用广泛,但是长期使用后会导致土壤残留量增加,影响后茬作物的正常生长。残留在土壤中的除草剂主要是由微生物降解。本研究从药害土壤中分离甲氧醚草烟和咪唑乙烟酸高效降解菌23株,对降解菌进行生物学鉴定,然后通过高效液相色谱研究高效降解菌的降解特性,并尝试克隆相关的基因,初步研究结果如下：从药害土壤中分离得到甲氧醚草烟和咪唑乙烟酸降解菌23株,其中甲氧醚草烟降解细菌8株,分别分别命名为IB1-8,真菌6株,分别分别命名为IF1-6；咪唑乙烟酸降解细菌5株,分别命名为HB1-5,真菌4株,分别命名为HF1-4。通过高效液相色谱法检测降解效率,其中细菌培养48h的降解率IB1-8为27.32-92.46%,HB1-HB5为24.67-45.12%,真菌培养7天降解率IF1-6为12.45-20.11%,HF1-HF4为9.12-25.78%。通过形态学和生理生化初步鉴定了细菌12株,真菌10株,其中IB1和IB2属于土壤杆菌属（Agrobacterium）, IB3和HB2属于短杆菌属（Brevibacterium）, IB 5属于不动杆菌属（Acinetobacter）, IB6和IB7属于棒状杆菌属（Coryynebacterium）, HB1和HB3属于假单胞菌属（Pseudomonas）, HB4属于微球菌属（Micrococcus）, HB5属于链球菌属（Streptococcus）。降解真菌通过不同培养基形态和染色后镜检后鉴定IF1、IF4、HF1同属于曲霉菌（Aspergillus）,IF2、IF3、IF6和HF2同属于青霉菌（Penicillium）, IF5初步鉴定为木霉菌（Trichoderma）,HF3属于毛霉菌（Mucor）,HF4属于根霉菌（Rhizopus）。在这些降解菌株中IB5降解效率最高,对其进行分子生物学鉴定和降解特性研究,并尝试克隆降解基因。降解菌株IB5在农药加无机盐的液体培养基中培养,IB5从6h开始进入对数生长期,18h进入稳定期,生长速度较快；该菌株温度的适应范围较广,在温度为25-40℃的条件下均能生长,最适生长温度为37℃；菌株在pH为5.0-9.0之间可以生长,最适pH值为7.0左右；在最适条件下测定降解效率,发现随着菌体数量的增加,培养液中的除草剂残留量逐渐减少,培养48h以后,培养液中的药液含量从800mg/L降低到60.32mg/L,降解效率达到92.46%,具有较高的降解效率。IB5通过16SrDNA序列比对分析并应用MEGA4构建系统发育图谱,发现其与不动杆菌属的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的16SrDNA序列的同源性最高,保守区相似性为99%,结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定IB5属于不动杆菌属,为鲍曼不动杆菌株,该菌属未有降解除草剂的相关报道。由于IB5降解效率较高,所以应用转座子标签和TAILPCR技术克隆降解基因。通过Tn5转座质粒pSZ21构建IB5降解缺陷型文库,得到418个具有降解缺陷型的菌株。以缺陷型菌株DNA为模板,应用TAIL-PCR技术得到1267bp的序列,分析后这段序列与新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）的二酚氧化酶（diphenol oxidase）的同源性达到97%,该类氧化酶主要是通过分子氧氧化酚形成对应的醌,可能在甲氧醚草烟的降解过程中起到一定的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 我国长残效除草剂应用概述
• 1.2 除草剂在土壤环境中的归趋
• 1.3 除草剂微生物降解和土壤生物修复作用
• 1.3.1 降解除草剂微生物类群
• 1.3.2 微生物降解除草剂机理
• 1.3.3 除草剂降解酶、降解基因及其相关代谢方式
• 1.4 咪唑啉酮类除草剂概况
• 1.4.1 甲氧醚草烟
• 1.4.2 咪唑乙烟酸
• 1.4.3 咪唑啉酮类除草剂在我国的使用现状及其药害
• 1.5 本研究目的意义
• 1.6 研究内容和技术路线图
• 1.6.1 研究主要内容
• 1.6.2 技术路线图
• 第2章 甲氧醚草烟降解菌的分离鉴定及降解特性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 土样采集
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基成分及其配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 降解菌株的富集驯化
• 2.2.2 降解菌株的分离
• 2.2.3 降解细菌鉴定
• 2.2.4 降解真菌鉴定
• 2.2.5 降解效率测定
• 2.2.6 高效降解菌降解特性研究
• 2.2.7 降解菌对敏感作物降解修复研究
• 2.2.8 高效降解菌的抗生素敏感性试验
• 2.2.9 高效降解菌株的降解广谱性研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 降解菌株筛选结果
• 2.3.2 甲氧醚草烟标准曲线
• 2.3.3 降解菌的降解效率测定
• 2.3.4 降解菌的鉴定
• 2.3.5 高效降解菌IB5降解特性研究
• 2.3.6 甲氧醚草烟降解细菌敏感作物降解菌修复研究
• 2.3.7 降解细菌的抗生素敏感性
• 2.3.8 降解细菌降解广谱性研究
• 2.4 本章小结
• 第3章 咪唑乙烟酸降解菌的分离鉴定以降解效率测定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 土样采集
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基成分及其配制
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 降解菌株的富集驯化
• 3.2.2 降解菌株的分离
• 3.2.3 降解细菌鉴定
• 3.2.4 降解真菌鉴定
• 3.2.5 降解效率测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 降解菌株筛选结果
• 3.3.2 咪唑乙烟酸标准曲线
• 3.3.3 降解菌的降解效率测定
• 3.3.4 降解菌的鉴定
• 3.4 本章小结
• 第4章 甲氧咪草烟降解菌IB5相关降解基因克隆
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒的提取
• 4.2.2 质粒消除
• 4.2.3 琼脂糖电泳检测
• 4.2.4 感受态细胞的制备
• 4.2.5 质粒转化
• 4.2.6 突变体文库构建
• 4.2.7 缺陷型菌株基因组DNA提取
• 4.2.8 TAIL-PCR克隆降解基因
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 IB5质粒及其消除
• 4.3.2 降解功能缺陷型文库的构建
• 4.3.3 转座子Tn5右翼序列克隆
• 4.3.4 转座子Tn5左翼序列克隆
• 4.3.5 克隆基因分析
• 4.4 本章小结
• 第5章 讨论
• 5.1 咪唑啉酮类除草剂降解微生物
• 5.1.1 降解细菌及其降解能力形成
• 5.1.2 降解真菌及其降解途径
• 5.1.3 细菌与真菌降解能力的差异比较
• 5.2 除草剂降解菌最适生长条件与田间应用条件关系
• 5.3 降解菌株的降解广谱性实践意义
• 5.4 降解基因与工程菌株的应用前景
• 第6章 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间学术成果
• 致谢