论文摘要
目的研究人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast,HELF）后对其细胞周期及复制前复合物（pre- replication complex,pre-RC）的影响。探讨HCMV感染的发病机制。方法1、血清饥饿法同步化HELF于G0/G1期,用HCMV感染同步化的HELF作为感染组（细胞数=1×106）,同时设模拟感染组为对照组（细胞数=1×106）。用倒置相差显微镜观察两组细胞形态学变化至感染后7天,于感染后12、24、48、72和96小时收获细胞。2、流式细胞仪检测HELF细胞周期。3、免疫细胞化学法检测两组HELF细胞核内HCMV IE172蛋白,Cdt1蛋白水平。4、提取总RNA,用半定量逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组HELF复制前复合物Cdt1 mRNA、Cdc6 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表达水平。5、RT-PCR法检测两组HELF复制抑制因子Geminin的表达水平。结果1、两组HELF细胞形态学变化:感染组HELF感染后72h时即可见局部细胞变圆,膨胀,细胞体及细胞核巨大化,7天时可见所有细胞均发生病变;模拟感染组HELF各时间点均未见细胞形态学改变。2、两组HELF HCMV IE172蛋白阳性产物表达:感染组HELF于感染后12h时细胞核内即出现呈棕黄色颗粒的HCMV IE172蛋白产物的表达;模拟感染组HELF各时间点均未出现HCMV IE172蛋白阳性产物。3、两组HELF细胞周期检测结果:感染组在感染后12h时有70.4%的细胞处于G1期,24h时有69.9%的细胞处于G1期;模拟感染组在感染后12h时有65.7%的细胞处于G1期,24h时有43.8%的细胞处于G1期。感染组HELF停滞G1期于较模拟感染组明显增多,两组比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）。4、两组HELF Cdt1 mRNA表达水平:模拟感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平最高,后逐渐下降,至72h时达最低水平,96h时又稍有回升。感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平较低,24h时稍有升高,48h达最高峰,72h时开始下降,96h时大致维持72h水平。两组比较,12h、24h和48h时Cdt1 mRNA表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）,12h和24h时感染组较模拟感染组明显降低,48h时感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组Cdt1 mRNA表达水平的高峰出现在感染后12h,而感染组的高峰则出现在感染后48h,较模拟感染组明显滞后。5、两组HELF Cdt1蛋白水平:12h、24h、和96h时两组HELF Cdt1蛋白水平差异均有统计学意义（P＜0.05）,48h、72h时两组HELF Cdt1蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。12h和96h时感染组较模拟感染组明显降低,24h时感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组在感染后12h时Cdt1蛋白表达水平最高,后逐渐下降,至24h时达最低水平,96h时又稍有回升;感染组在感染后12h时Cdt1蛋白表达水平较低,24h时达到最高峰,48h时急剧下降,一直维持较低的稳定水平。6、两组HELF Cdc6 mRNA表达水平:12h、24h、48h、72h和96h时两组HELF Cdc6 mRNA表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）,12h、24h和48h时感染组较模拟感染组明显增加,72h和96h时模拟感染组较感染组明显升高。感染组在感染后12h时Cdc6 mRNA表达水平最高,后逐渐下降,至72h时达最低水平,96h时又稍有回升;模拟感染组在感染12h时Cdc6 mRNA表达水平最高,后逐渐下降,至48h时达最低水平,72h后开始回升,96h时继续回升。7、两组HELF Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表达水平:12h、24h、48h、72h、96h时两组HELF Mcm2 mRNA、Mcm8mRNA表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）,12h和24h时感染组表达水平低于模拟感染组,48h、72h、96h时感染组表达水平明显高于模拟感染组。模拟感染组Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA表达水平的高峰出现在感染后24h,而感染组表达水平的高峰则出现在感染后48h,较模拟感染组有明显滞后。8、两组HELF Geminin mRNA表达水平:12h、24h、48h和72h时两组HELF Geminin mRNA表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）,12h和24h时感染组较模拟感染组明显增加,48h和72h时感染组较模拟感染组明显降低。感染组在感染后12h时Geminin mRNA表达水平最高,模拟感染组在感染后48h达最高峰。结论1、人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞后在其细胞核内进行复制、增殖。2、人巨细胞病毒感染阻滞了人胚肺成纤维细胞周期,使大部分细胞停滞在G1期。3、人巨细胞病毒IE172蛋白的表达提示人巨细胞病毒的早期感染。4、人巨细胞病毒感染使人胚肺成纤维细胞复制前复合物主要成份Cdt1 mRNA、Mcm2 mRNA、Mcm8 mRNA的表达水平迟滞、Cdt1蛋白表达延迟。Cdc6 mRNA高水平表达。5、人巨细胞病毒感染能诱导人胚肺成纤维细胞复制抑制因子Geminin异常表达,使Geminin/pre-RC平衡失调,阻止复制前复合物的形成,DNA合成障碍。这可能是人巨细胞病毒感染导致人胚肺成纤维细胞周期阻滞于G1期的机制。
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