脂联素对皖南花猪性腺发育的影响

论文摘要

皖南花猪是安徽省优良的地方猪种，其优良的遗传品质和较强的繁殖性能在中国猪种中具有明显的独特性。脂肪组织分泌的细胞因子很多与生殖相关，而脂联素（Adp）作为脂肪组织分泌最多的一种生物活性物质，与生殖的关系十分密切。本试验通过分析皖南花猪血清中性激素含量的发育性变化规律及性腺组织中脂联素受体与性腺中性激素合成因子表达量的发育性变化规律与相关性，探讨Adp与皖南花猪生殖作用的联系。通过重组脂联素（rAdp）对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞的影响，探索Adp对生殖激素合成的影响及机制。1皖南花猪血清性激素含量的发育性变化及性腺中相关基因时序性表达选择0d、30d、45d、90d、180d不同日龄皖南花猪进行试验，各日龄样本数10头（公、母各5头）。ELISA法测定公猪血清中T和母猪血清中E2的水平；RT-PCR法检测睾丸和卵巢组织中AdpR1、A dpR2、L HR、F SHR、S tAR、C YP11A1、C YP19mRNA表达。结果显示：（1）皖南花猪公猪各日龄中血清T浓度有极显著发育性变化（P<0.01），表现为045d显著下降，而后维持稳定。皖南花猪母猪各个日龄E2浓度也有极显著的发育性变化（P<0.01），整体表现为先降低，再升高，然后趋于稳定状态。0d与45d母猪血清E2浓度有两个峰值，30d、90d和180d差异不显著。（2）AdpR1mRNA在睾丸中的发育性变化极显著（P<0.01），AdpR2mRNA在睾丸中的发育性变化整体表现为上升趋势。A dpR1mRNA在卵巢中有显著的发育性变化（P<0.05），AdpR2mRNA在卵巢中有极显著的发育性变化（P<0.01）。睾丸和卵巢AdpR1mRNA的表达量均高于AdpR2mRNA。（3）C YP11A1、St AR和LHR mRNA在睾丸中表达量有显著的发育性变化（P<0.01或P<0.05）；F SHR mRNA在卵巢中表现为极显著的发育性变化模式（P<0.01），C YP19mRNA无显著性发育变化。（4）相关性分析结果：睾丸组织中AdpR1与CYP11A1mRNA表达量显著相关（r=0.587，P<0.05）；LHR分别与CYP11A1和StAR mRNA表达量显著相关（r=0.528，P <0.05；r=0.552，P <0.05）； CYP11A1与StAR mRNA表达量极显著正相关（r=0.709，P<0.01）。卵巢组织中AdpR1mRNA与AdpR2mRNA显著正相关（r=0.380，P <0.05）；A dpR1mRNA与CYP19mRNA显著负相关（r=-0.472，P<0.05）。以上结果表明：AdpR1mRNA在睾丸组织的高表达提示脂联素可能通过AdpR1介导对睾丸的调节作用，其发育性变化和CYP11A1mRNA呈正相关，提示脂联素对睾酮的生成有一定的促进作用。卵巢组织中AdpR1mRNA与CYP19mRNA的负相互作用影响卵巢中E2的合成。 AdpR1、AdpR2mRNA的正相关，AdpR1mRNA的高表达，AdpR1mRNA与CYP19mRNA的负相关性提示脂联素对卵巢的作用通过AdpR1对卵巢中E2的分泌起抑制作用。2脂联素对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞性激素生成的影响及机制选取10d皖南花猪公猪，无菌条件下取睾丸组织分离培养间质细胞；选取卵巢颗粒细胞进行相关处理后进行增殖培养。传代培养两天后用rAdp处理，12h后ELISA法测定间质细胞培养液中T和颗粒细胞培养液中E2的水平；荧光定量实时PCR法检测睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞中AdpR1、AdpR2、LHR、FSHR、StAR、CYP11A1、CYP19mRNA表达量。结果显示：（1）细胞培养液中T和E2的浓度变化：2μg/mL rAdp处理后的睾丸间质培养液上清中T显著升高（P<0.05），而Compound C+2μg/mL Adp处理后T浓度有下降趋势，但差异不显著。U0126+2μg/mL rAdp处理后T浓度有上升的趋势，但差异不显著。2μg/mL rAdp处理后的卵巢颗粒细胞上清液中E2无显著变化。（2）细胞中相关基因表达量的变化：睾丸间质细胞：rAdp能极显著增加AdpR1mRNA的表达量，rAdp处理后AdpR2mRNA的表达量有一定上升趋势。r Adp极显著抑制StAR mRNA的表达；对CYP11A1mRNA的合成影响不大。此外，rAdp使AMPK mRNA表达量极显著上升。培养液中T的上升与T合成相关基因表达不一致，可能与T浓度的上升导致睾酮合成的负反馈机制的启动有关。但培养液中T终浓度的上升提示Adp可能通过AdpR1作用于睾丸间质细胞，引起AMPK途径的激活，增强T的合成。卵巢颗粒细胞：rAdp对AdpR1mRNA表达量无影响，而对AdpR2mRNA有显著抑制作用。rAdp极显著抑制CYP19mRNA的表达。此外，rAdp使AMPK mRNA极显著下降。结果提示Adp作用于卵巢颗粒细胞通过AdpR2抑制AMPK途径，抑制CYP19mRNA的表达。结合体内试验的结果，Adp可能通过AdpR1、AdpR2共同影响雌二醇合成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文中出现的英文缩写集
• 文献综述
• 1 皖南花猪简介
• 2 脂联素的作用与脂联素受体在猪睾丸和卵巢中的表达
• 3 睾丸及卵巢组织中性激素合成相关因子
• 4 猪血清和性腺组织中性激素发育性变化
• 5 脂联素与生殖间相互作用
• 6 脂联素对生殖的影响的分子调控
• 7 本研究的目的和意义
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物的饲养
• 1.2 样本采集
• 1.3 主要试验仪器及试剂
• 1.3.1 主要试验仪器
• 1.3.2 主要试验试剂
• 1.3.3 培养液及相关试剂的配制
• 1.4 睾丸间质细胞的分离与培养
• 1.5 颗粒细胞的培养
• 1.6 细胞处理实验设计
• 1.7 细胞的鉴定及定位
• 1.8 MTT 法检测细胞增殖活力
• 1.9 血清和培养液中相关激素含量的测定（ELISA 法）
• 1.9.1 血清中睾酮含量测定
• 2 含量测定'>1.9.2 血清和培养液中 E₂含量测定
• 1.10 荧光实时定量 RT-PCR 方法测定各基因表达水平
• 1.10.1 睾丸和卵巢组织中的总 RNA 的提取
• 1.10.2 细胞总 RNA 提取
• 1.10.3 总 RNA 提取质量检测
• 1.10.4 反转录合成 cDNA
• 1.10.5 cDNA 纯度鉴定
• 1.10.6 PCR 引物的设计
• 1.10.7 实时荧光定量 PCR（RT-PCR）
• 1.10.8 相关基因实时荧光定量 PCR 检测
• 1.11 数据分析
• 2 结果
• 2.1 皖南花猪公猪血清睾酮含量以及母猪血清雌二醇含量
• 2.2 rAdp 对猪睾丸间质细胞睾酮和对猪颗粒细胞雌二醇释放的影响
• 2.3 试验样品 RNA 质量的检测结果
• 2.4 cDNA 纯度鉴定
• 2.5 培养的猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒的鉴定
• 2.5.1 PCR 法扩增睾丸间质细胞特异性表达的 CYP17 基因
• 2.5.2 间质细胞正常生长及 HE 染色结果
• 2.5.3 卵巢颗粒细胞的鉴定
• 2.6 rAdp 对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞相对活力的影响
• 2.7 荧光实时定量 RT-PCR 标准曲线的建立及其扩增曲线
• 2.8 皖南花猪睾丸组织中 AdpR1、AdpR2、LHR、CYP11A1、StAR mRNA 表达的发育性变化
• 2.8.1 脂联素受体 mRNA 在睾丸中的表达
• 2.8.2 睾丸合成相关因子 mRNA 在睾丸中的表达
• 2.9 皖南花猪卵巢组织中 AdpR1、AdpR2、FSHR、CYP19 mRNA 表达的发育性变化
• 2.9.1 脂联素受体 mRNA 在卵巢中的表达：
• 2.9.2 卵巢合成相关因子 mRNA 在卵巢中的表达
• 2.10 相关性分析结果
• 2.11 rAdp 对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞 AdpR1 和 AdpR2 基因表达的影响
• 2.12 rAdp 对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞性激素合成相关因子 mRNA 的影响
• 2.13 rAdp 对猪睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞 AMPK 基因表达的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文