棉花遗传转化体系的优化及突变体的创制

论文摘要

棉花是重要的经济作物，利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植效益。然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多障碍，主要表现在棉花体细胞胚胎发生对基因型依赖性很强、周期长、导致再生植株的体细胞变异很严重；棉花遗传转化技术的复杂性（难重复、转化率低）和转基因棉花的农艺性状的变异等等，这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的瓶颈。本研究内容主要涉及棉花高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选、棉花体细胞无性系变异研究、高效棉花遗传转化体系的建立，棉花胚芽为转化受体的新的转化方法以及一个小型的promoter-trap插入突变体库的建立，旨在为转基因棉花育种、功能基因组研究提供理论指导。主要研究结果如下： 1 对三十个优良棉花基因型进行离体培养，系统地比较了它们的体细胞胚胎发生能力。筛选到两个体细胞胚胎发生能力明显高于珂字棉的基因型一‘豫668’和‘豫早1号’，这两个基因型能够在两个月内获得高频率的体细胞胚胎发生，为棉花的遗传工程的发展拓宽了受体范围。 2 棉花体细胞无性系变异的研究。利用细胞学压片、流式细胞仪检测及RAPD技术对棉花体细胞胚胎发生获得的再生植株的遗传稳定性进行了评估，研究发现随机挑选的14个再生植株的DNA倍性、染色体数目没有发生变异，而利用187条RAPD引物对再生植株进行检测发现50％再生植株（14株中的7株）存在RAPD扩增多态性，这意味着细胞学水平的遗传变异与DNA水平的遗传变异没有必然联系。在国际上首次利用RAPD和SSR技术对2，4-D+KT和IBA+KT这两种激素组合诱导的胚性愈伤的遗传稳定性进行了检测。发现两者诱导的胚性愈伤组织胚胎发生能力没有明显差异，但2，4-D+KT组合诱导到的胚性愈伤组织在DNA水平上的变异程度要比IBA+KT组合诱导的胚性愈伤组织高。 3 农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的优化及以GFP为报告基因对棉花下胚轴遗传转化的观察。 预培养15d的棉花胚性愈伤组织是较好遗传转化受体材料，对转化的影响因子进行比较实验，结果表明利用OD值为0.5的农杆菌菌液，在共培培养基中加入50mg／L的乙酰丁香酮，19℃下，暗培养48小时，用100mg／l的卡那霉素进行选择，400mg／l的头孢霉素抑制农杆菌的生长能够获得较高的转化效率。利用这些参数转化能够使胚性愈伤组织转化率达到15.0％左右。 为了克服棉花转基因植株移栽困难的不利影响，建立了一种新的试管苗嫁接移栽技术。以棉花去壳种子消毒后在培养基中萌发的无菌苗作为砧木，在无菌条件下，

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 第一章 棉花组织培养及生物技术研究进展
• 1.1 棉花组织培养的概述
• 1.1.1 棉花组织培养及植株再生
• 1.1.1.1 愈伤组织的诱导和培养
• 1.1.1.2 植株再生
• 1.1.2 响体细胞胚发生和植株再生的因素
• 1.1.2.1 基因型
• 1.1.2.2 外植体
• 1.1.2.3 激素
• 1.1.2.4 培养条件
• 1.2 植物体细胞无性系变异研究进展
• 1.2.1 体细胞无性系变异特点及遗传基础
• 1.2.2 植物体细胞无性系变异的影响因素
• 1.2.2.1 外植体中预存的变异
• 1.2.2.2 外植体的基因型和类型
• 1.2.2.3 植株再生方式
• 1.2.2.4 培养时间、继代次数的影响
• 1.2.2.5 培养方式对体细胞变异的影响
• 1.3 植物转基因研究进展
• 1.3.1 植物遗传转化的发展
• 1.3.2 植物遗传转化的方法
• 1.3.2.1 根癌农杆菌介导的基因转移
• 1.3.2.2 基因枪转化法
• 1.3.2.3 PEG法
• 1.3.2.4 显微注射法（microiniection）
• 1.3.2.5 电激法
• 1.3.2.6 碳化硅纤维介导转化法
• 1.3.2.7 子房注射法
• 1.3.2.8 其它方法
• 1.3.3 棉花的遗传转化
• 1.3.4 影响农杆菌T-DNA转移的因素
• 1.4 GFP报告基因的利用
• 1.4.1 发光机制
• 1.4.2 GFP的应用领域
• 1.5 植物突变体库创建与功能基因组研究
• 1.5.1 植物突变体库的创建
• 1.5.1.1 理化诱变
• 1.5.1.2 植物转座子标签
• 1.5.1.3 农杆菌介导的T-DNA插入突变
• 1.5.2 经典的插入突变克隆基因的不足
• 1.5.3 Gene trap技术在植物功能基因组研究中的应用
• 1.6 本课题的研究目的与意义
• 1.6.1 高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选
• 1.6.2 棉花体细胞无性系变异的研究
• 1.6.3 农杆菌介导棉花转化体系的优化
• 1.6.4 新的转化方法的探讨
• 1.6.5 promoter-trap突变群体的初步研究
• 第二章 高体细胞胚胎发生能力基因型的筛选
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 品种（系）材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 棉花组织培养所用培养基和培养条件
• 2.1.2.2 棉花体细胞再生的培养体系
• 2.1.2.3 愈伤秤重、形态及细胞学压片观察
• 2.1.2.4 不同基因型棉花品种（系）的再生能力比较
• 2.1.2.5 数据统计与分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同基因型的愈伤组织诱导
• 2.2.2 不同品种（系）的愈伤组织增殖及分化能力比较
• 2.2.3 三个棉花品种体细胞发生能力的保持的比较研究
• 2.3 讨论
• 第三章 棉花组织培养中的体细胞无性系变异研究
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 体细胞胚胎发生及植株再生
• 3.2.2 再生植株的倍性分析
• 3.2.3 再生植株的细胞学压片
• 3.2.4 再生植株的RAPD多态性研究
• 3.2.5 两种不同激素组合诱导的胚性愈伤组织再生能力的比较
• 3.2.6 两种不同激素组合诱导的胚性愈伤组织的RAPD、SSR多态性研究
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 流式细胞仪检测再生植株的倍性
• 3.3.2 再生植株的细胞学压片观察
• 3.3.3 再生植株的RAPD多态性
• 3.3.4 两种激素诱导的愈伤组织再生能力的比较
• 3.3.5 两种激素诱导的胚性愈伤组织的RAPD、SSR多态性研究
• 3.3.6 聚类结果分析
• 3.4 讨论
• 第四章 农杆菌介导的棉花遗传转化的研究
• 4.1 农杆菌介导的棉花胚性愈伤组织遗传转化
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 棉花胚性愈伤组织的根癌农杆菌转化体系
• 4.1.2.1 培养基及培养条件
• 4.1.2.2 转化方法
• 4.1.3 转化愈伤及再生植株的分子检测
• 4.1.3.1 基因组DNA抽提（大量法）
• 4.1.3.2 小量抽提法（用于PCR扩增）
• 4.1.3.3 PCR分析
• 4.1.3.4 Southern杂交（参照Sambrook,2002进行）
• 4.1.4 根癌农杆菌转化‘YZ-1’胚性愈伤组织的条件优化
• 4.1.4.1 农杆菌菌株对转化效率的影响
• 4.1.4.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响
• 4.1.4.3 乙酰丁香酮（AS）与农杆菌侵染效率
• 4.1.4.4 共培养温度与农杆菌侵染
• 4.1.4.5 共培养时间与农杆菌侵染
• 4.1.4.6 愈伤组织生理状态与农杆菌侵染
• 4.2 转基因再生植株的嫁接移栽试验
• 4.2.1 普通嫁接
• 4.2.2 试管内嫁接移栽技术
• 4.3 GFP作为报告基因研究下胚轴为转化受体的棉花遗传转化
• 4.3.1 试验材料：
• 4.3.2 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化
• 4.3.3 GFP荧光检测
• 4.3.4 转化细胞的生长特性观察及其分化调控
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 农杆菌转化棉花胚性愈伤组织的参数优化研究
• 4.4.1.1 农杆菌菌株对转化效率的影响
• 4.4.1.2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响
• 4.4.1.3 乙酰丁香酮对转化效率的影响
• 4.4.1.4 共培养温度对对转化效率的影响
• 4.4.1.5 共培养时间对转化效率的影响
• 4.4.1.6 愈伤组织生理状态对对转化效率的影响
• 4.4.2 农杆菌介导的‘YZ-1’的胚性愈伤组织遗传转化体系的建立
• 4.4.3 抗性愈伤组织的PCR鉴定
• 4.4.4 转基因再生植株的Southern杂交检测
• 4.4.5 转基因再生植株的嫁接移栽技术
• 4.4.6 GFP作为报告基因研究下胚轴为转化受体的遗传转化
• 4.4.6.1 GFP的瞬时表达和稳定表达
• 4.4.6.2 转基因愈伤组织的形态结构、生长发育特性研究
• 4.4.6.3 不同基因型的材料遗传转化特性
• 4.4.6.4 GFP转化愈伤的分化调控
• 4.5 讨论
• 第五章 棉花胚芽为转化受体的遗传转化
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 根癌农杆菌和转化载体
• 5.1.3 转化方法
• 5.1.3.1 胚芽的剥离
• 5.1.3.2 超声波辅助农杆菌转化处理
• 5.1.3.3 转化及植株再生过程
• 5.1.4 GFP瞬时表达观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 超声波辅助的棉花胚芽的遗传转化体系的建立
• 5.2.2 不同超声波功率、处理时间对超声波处理效果的影响
• 5.2.3 不同的介质对超声波处理效果的影响
• 5.2.4 不同的基因型对超声波处理效果的影响
• 5.2.5 抗虫基因的SAAT转化
• 5.3 讨论
• 第六章 PROMOTER-TRAPPING突变群体的初步研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 品种
• 6.1.2 农杆菌菌株和转化载体
• 6.1.3 以胚性愈伤组织为受体的遗传转化
• 6.1.4 转化愈伤及再生植株不同器官的GUS染色
• 6.1.5 再生植株的分子生物学鉴定
• 6.1.6 转基因当代材料的农艺性状考察
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 转基因再生植株的农艺性状考察
• 6.2.2 转基因再生植株农艺性状的变异规律
• 6.2.3 转基因再生植株的PCR检测
• 6.2.4 转基因再生植株的Southern杂交分析
• 0代群体GUS检测'>6.2.5 Promoter-trap T₀代群体GUS检测
• 6.2.5.1 GUS基因在突变群体的表达频率
• 6.2.5.2 GUS基因在根中的表达模式
• 6.2.5.3 GUS基因在花器官中的表达模式
• 6.2.5.4 GUS基因在营养器官中的表达模式
• 6.2.5.5 GUS基因在不同体细胞胚胎发育阶段中的表达频率
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢