辽宁碱蓬BADH基因启动子功能分析

论文摘要

甜菜碱醛脱氢酶（BADH）是合成甜菜碱的关键酶,甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂,在植物耐盐中起着重要的作用。BADH基因受盐诱导表达,随着环境中盐浓度的提高,BADH基因表达量增加。该基因的诱导表达特性一定与其启动子有关。本文对辽宁碱蓬BADH基因启动子进行了研究。研究BADH基因启动子对分析BADH基因表达调控机制具有一定的理论意义,获得盐诱导启动子区段,应用于植物基因工程,对提高转基因植物的耐盐性具有重要的应用价值。本研究利用PLACE和PlantCARE软件对已获得的辽宁碱蓬BADH基因启动子序列（1993bp）进行分析,发现该序列具有启动子的基本组成元件TATA-box、CAAT-box,包含多个胁迫诱导元件,如3个盐诱导元件GT-1 motif（sGAAAAA）,6个缺水、脱落酸、抗冻、抗寒元件MYC识别位点（CANNTG）,9个伤害诱导元件WUN-motifs（ANATTNCNN）,11个热激元件HSE（ATAAATGT）等。根据该启动子序列设计5个正向引物分别与1个反向引物配对,PCR扩增获得了BADH基因起始密码子上游不同长度启动子片段:P1（-1993+62bp）、P2（-1466+62bp）、P3（-1084+62bp）、P4（-573+62bp）、P5（-300+62bp）。通过酶切、纯化、连接,各启动子片段定向插入pCAMBIA1301载体中,取代原有的CaMV 35S启动子,与GUS报告基因连接,构建了5个植物表达载体:pCAMBIA1301-P1、pCAMBIA1301-P2、pCAMBIA1301-P3、pCAMBIA1301-P4、pCAMBIA1301-P5。5个植物表达载体经农杆菌介导的叶盘转化法分别转到烟草中,筛选出潮霉素抗性的转基因烟草阳性植株,经PCR检测、GUS检测获得阳性植株,表明各启动子片段已转入烟草中,且能驱动GUS基因的表达。用不同浓度NaCl处理转基因烟草阳性植株48h后,GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析,结果表明:随着盐浓度的升高,各启动子片段驱动的GUS活性增加,400mmol/L NaCl诱导时,P5（-300+62bp）启动子片段的GUS活性是未经NaCl诱导时的6.3倍,表明P5启动子具有启动子活性,是一个强的盐诱导表达启动子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 高等植物启动子的研究进展
• 1.1 高等植物启动子的基本组成
• 1.1.1 转录起始位点
• 1.1.2 TATA-box
• 1.1.3 一般上游启动子元件
• 1.1.3.1 CAAT-box
• 1.1.3.2 GC-box
• 1.1.4 特有的上游启动子元件
• 1.2 高等植物诱导型启动子
• 1.2.1 光诱导表达启动子
• 1.2.2 温度诱导表达启动子
• 1.2.2.1 热诱导表达启动子
• 1.2.2.2 冷诱导表达启动子
• 1.2.3 水分诱导表达启动子
• 1.2.3.1 低氧（或无氧）诱导表达启动子
• 1.2.3.2 脱水诱导表达启动子
• 1.2.4 植物激素诱导表达启动子
• 1.2.4.1 脱落酸诱导表达启动子
• 1.2.4.2 乙烯诱导表达启动子
• 1.2.4.3 茉莉酸甲酯诱导表达启动子
• 1.2.5 伤害诱导表达启动子
• 1.2.6 NaCl 诱导表达启动子
• 1.3 启动子的应用前景
• 2 BADH 基因及其启动子
• 3 本研究的目的和意义
• 4 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 菌株和质粒
• 1.5 PCR 引物
• 1.6 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 BADH 基因启动子序列分析
• 2.2 BADH 基因启动子5' 端缺失片段的获得
• 2.2.1 pMD18T-BADH （p）质粒的提取
• 2.2.2 PCR 获得不同长度缺失片段
• 2.2.3 不同长度缺失片段的限制性酶双酶切
• 2.2.4 不同长度缺失片段的回收
• 2.3 pCAMBIA1301 载体大片段的获得
• 2.3.1 pCAMBIA1301 质粒的提取
• 2.3.2 pCAMBIA1301 载体的限制性酶双酶切
• 2.3.3 载体大片段的回收
• 2.4 BADH 基因启动子各缺失片段与GUS 基因融合表达载体构建
• 2.4.1 BADH 基因启动子不同长度缺失片段与载体大片段的连接
• 2.4.2 连接产物的转化
• 2.4.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2.2 热激法转化大肠杆菌
• 2.4.2.3 转化产物的检测
• 2.5 植物表达载体转化根癌农杆菌
• 2.5.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.5.2 冻融法转化农杆菌
• 2.5.3 农杆菌的PCR 检测
• 2.6 根癌农杆菌介导转化烟草及抗性芽的筛选
• 2.6.1 转化用烟草叶片的预培养
• 2.6.2 农杆菌的培养
• 2.6.3 浸染
• 2.6.4 抗性芽的筛选及转基因植株在潮霉素中的生根培养
• 2.6.5 转基因植株的PCR 检测
• 2.6.5.1 转基因烟草叶片总DNA 的提取
• 2.6.5.2 PCR 检测
• 2.6.6 转基因植株的GUS 组织化学染色检测
• 2.7 BADH 基因启动子不同区段盐诱导功能分析
• 2.7.1 转基因烟草的盐处理
• 2.7.2 GUS 组织化学分析
• 2.7.3 GUS 荧光定量分析
• 第三章 结果与分析
• 1 BADH 基因启动子序列分析
• 2 BADH 基因启动子5'端缺失片段与pCAMBIA1301 载体大片段的获得
• 2.1 pMD18T-BADH （p）与pCAMBIA1301 质粒的提取
• 2.2 PCR 扩增获得BADH 基因启动子5'端缺失片段
• 2.3 不同长度缺失片段与pCAMBIA1301 载体的限制性酶双酶切
• 2.4 不同长度缺失片段与载体大片段的回收
• 3 BADH 基因启动子各缺失片段与GUS 基因融合表达载体构建
• 3.1 PCR 检测
• 3.2 双酶切检测
• 4 植物表达载体转化根癌农杆菌
• 5 根癌农杆菌介导转化烟草及抗性芽的筛选
• 5.1 抗性芽的筛选及转基因植株在潮霉素中的生根培养
• 5.2 转基因植株的PCR 检测
• 5.3 转基因植株的GUS 组织化学染色检测
• 6 BADH 基因启动子不同区段盐诱导功能分析
• 6.1 GUS 组织化学分析
• 6.2 GUS 荧光定量分析
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢