发酵床养猪中益生菌对主要病原细菌的控制效果初探

论文摘要

发酵床养猪技术是一种新兴的环保养猪技术，它利用全新的自然农业理念，结合现代发酵处理技术将从自然环境中筛选出来的益生菌按照一定的比例与谷壳、锯末和一些活性剂混合发酵制作成有机垫料层，之后铺设到猪场水泥地板上，猪排泄的粪尿通过垫料中的益生菌进行充分的分解转化成有机物质，从而达到零排放、无污染、资源循环利用的环保养殖目的。目前国内对养猪发酵床的研究还处于初级阶段，对于发酵床为什么能够有效地控制常见猪病害的发生，还没有明确的定论。本论文正是针对此问题，利用分子生物学手段研究了生物发酵床中的微生物群落结构和益生菌与主要致病菌的数量变化趋势，以及益生菌与致病菌之间的抑制竞争关系，初步探明了发酵床中益生菌对主要病原细菌的控制机理。通过利用变性梯度凝胶电泳的手段分析了不同时期和不同地区的发酵床垫料，发现主要存在的益生菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum），其中分布最广泛的是枯草芽孢杆菌。垫料中主要的致病菌包括有大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella enterica）、短稳杆菌（Empedobacter）和不动杆菌（Acinetobacter），其中普遍存在的是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。不同时期采集的猪垫料中枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR分析结果表明枯草芽孢杆菌的数量基本上维持在105cfu/g到107cfu/g的数量级；大肠杆菌的数量在103cfu/g到105cfu/g的数量级；金黄色葡萄球菌的数量级范围从102cfu/g到104cfu/g，而益生菌枯草芽孢杆菌的数量要比其他两种致病菌高出10-100倍，益生菌抑菌特性的研究结果进一步显示，枯草芽孢杆菌的原始发酵液以及经过pH5-9和80℃的高温处理的发酵液都能够有效的抑制猪场常见的肺炎克雷伯斯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）、乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、伯克霍尔德氏菌（Burkholderiales bacterium）、金黄色葡萄球菌、鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、沙门氏菌、大肠杆菌、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）等致病菌。本论文的研究从某种程度上揭示了益生菌能够将致病菌控制在寄主不发病范围内的作用机理。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 现阶段规模化猪场主要流行的细菌性病害
• 1.1.1 高致病性大肠杆菌病
• 1.1.2 葡萄球菌病
• 1.1.3 沙门氏菌病
• 1.1.4 猪链球菌病
• 1.1.5 副猪嗜血杆菌病
• 1.1.6 猪巴氏杆菌病
• 1.1.7 其他细菌性病害
• 1.2 发酵床养猪技术简介
• 1.3 变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）在微生物多态性研究中的应用
• 1.3.1 微生物分子多态性研究方法
• 1.3.2 变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）原理
• 1.3.3 变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）在微生物多态性研究中的应用
• 1.4 荧光定量 PCR 技术（FQ-PCR）在环境微生物检测中的应用
• 1.4.1 荧光定量 PCR 技术（FQ-PCR）原理
• 1.4.2 荧光定量 PCR 技术（FQ-PCR）在环境微生物检测中的应用
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 发酵床垫料中微生物总 DNA 提取条件的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂和仪器
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 DNA 的纯度和浓度检测结果
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 发酵床垫料中微生物群落的 PCR-DGGE 分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 样本的采集和预处理
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 DNA 提取结果
• 3.2.2 PCR 扩增结果
• 3.2.3 DGGE 分析结果
• 3.2.4 Quantity One 软件分析结果
• 3.2.5 DGGE 条带割胶回收测序
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 发酵床垫料中益生菌和主要致病菌的荧光定量分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 垫料微生物总 DNA 样本
• 4.1.2 供试菌株
• 4.1.3 引物和探针
• 4.1.4 PCR 扩增
• 4.1.5 质粒标准品的构建
• 4.1.6 质粒标准品的制备
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 常规 PCR 反应及产物测序结果
• 4.2.2 荧光定量标准曲线的制作结果
• 4.2.3 发酵床垫料中枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的定量检测
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 实时荧光定量 PCR 引物和探针的设计
• 4.3.2 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 标准曲线的制作
• 4.3.3 枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的定量检测
• 第五章 发酵床垫料中益生菌对猪主要的细菌病原的抑制作用
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 培养基和供试菌株
• 5.1.2 菌株活化
• 5.1.3 滤纸片法测定抑菌效果
• 5.1.4 枯草芽孢杆菌无菌发酵液的制备
• 5.1.5 枯草芽孢杆菌发酵液的不同温度处理
• 5.1.6 枯草芽孢杆菌无菌发酵液的不同 pH 处理
• 5.1.7 数据处理
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 益生菌和致病菌的菌液浓度测定
• 5.2.2 益生菌对致病菌的抑制效果
• 5.2.3 枯草芽孢杆菌对致病菌的抑菌效果检测
• 5.2.4 不同处理的枯草芽孢杆菌发酵液对致病菌的抑菌效果监测
• 5.3 结论与讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历