京亚和克瑞森葡萄高效再生体系建立

论文摘要

转基因技术已发展成为植物育种和分子设计的一种重要手段,当前在葡萄育种中应用的限制因子是再生体系。虽然过去有较多葡萄组织培养的报道,但大多采用侧芽培养的方法,不适合转基因再生要求。本试验以鲜食葡萄品种京亚和克瑞森无核的成年态为试材,经消毒、继代扩繁后,进一步以无菌试管苗的叶片为外植体,建立了叶盘法再生的技术体系,并为转基因技术应用做了部分前期探索。得出以下结论:1.对单芽茎段采用0.1%升汞和2%NaClO进行消毒,设计了不同消毒时间的组合,实验表明用2%NaClO消毒20 min灭菌效果最好。取材在4月中旬至5月中旬污染最低。2.初代培养基:京亚采用MS+6-BA 1.0mg/L,克瑞森采用MS+6-BA 2.0mg/L都能有效的诱导腋芽的萌发。继代增殖培养基:采用MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.1mg/L可以有效的诱导腋芽的增殖,增殖倍数在5倍以上。3.克服玻璃化:降低温度、增加琼脂含量都能够缓解组培苗的玻璃化,但都不能完全抑制玻璃化,随着温度的升高及继代次数的增加,玻璃化现象仍然严重。在继代增殖培养基中加入0.4mg/L的活性炭,虽然增殖倍数有所降低,但却可以完全抑制玻璃化,同时还可以为叶盘再生提供稳定而健壮的外植体材料。4.葡萄叶盘再生体系:克瑞森无核的叶盘再生最佳培养基为MS+6-BA5.0mg/L+IBA0.05mg/L,再生率为11.2%;京亚叶盘再生的最佳培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.05mg/L,再生率为65.2%。前2片展开叶是最理想的外植体,只切断叶片主脉而不将叶片完全切断、将叶片背面接触培养基也可以提高再生率。5.叶片再生芽生根的适宜培养基为1/2MS+IBA 1.0mg/L+7g/L Agar+30g/LSuc,处理须根多,茎杆粗壮,生根效果最为理想。6.遗传转化摸索发现:卡那霉素不适合京亚叶片再生筛选,只适合于生根筛选,浓度为10mg/L;Cef抑菌浓度为300 mg/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 葡萄高效离体再生系统的研究进展
• 1.2.1 葡萄高效离体再生系统的类型
• 1.2.2 高效离体再生系统的影响因素
• 1.3 葡萄基因工程研究进展
• 1.3.1 葡萄遗传转化受体系统
• 1.3.2 遗传转化途径
• 1.3.3 葡萄转化的主要影响因素
• 1.3.4 转化组织的有效筛选和检测
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 成年态离体培养体系建立
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 葡萄的叶盘再生
• 2.2.1 不同激素配比对叶片再生的影响
• 2.2.2 不同基本培养基对叶片再生的影响
• 2.2.3 暗培养时间对京亚葡萄叶片再生的影响
• 2.2.4 京亚葡萄不同叶位的再生情况
• 2.2.5 不同叶片切法对京亚葡萄再生的影响
• 2.2.6 叶片不同放置方式对京亚葡萄再生的影响
• 2.2.7 再生芽的伸长及扩繁
• 2.2.8 再生芽的生根
• 2.2.9 炼苗移栽
• 2.3 培养条件
• 2.4 京亚葡萄叶片转化体系初步探索
• 2.4.1 根癌农杆菌菌株及质粒
• 2.4.2 Km浓度筛选
• 2.4.3 农杆菌的活化和工程菌液的制备
• 2.4.4 抑菌试验
• 2.4.5 侵染时间、菌液浓度的探索
• 2.5 试验观察结果及数据统计方法
• 2.5.1 试验观察结果
• 2.5.2 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 成年态离体培养体系的建立
• 3.1.1 不同消毒方法对葡萄污染、褐化及成活率的影响
• 3.1.2 不同取材时期对葡萄污染、褐化及成活率的影响
• 3.1.3 初代培养基的筛选
• 3.1.4 不同激素配比对外植体增殖的影响
• 3.1.5 几种控制玻璃化的措施对抑制玻璃化现象的效果
• 3.2 叶盘法再生体系的建立
• 3.2.1 不同细胞分裂素对叶片再生的影响
• 3.2.2 不同激素配比对叶片再生的影响
• 3.2.3 基本培养基对叶片再生的影响
• 3.2.4 不同叶位对京亚葡萄叶片再生的影响
• 3.2.5 不同暗培养天数对京亚葡萄叶片再生的影响
• 3.2.6 不同放置方法对京亚葡萄叶片再生的影响
• 3.2.7 不同的切法对京亚葡萄叶片再生的影响
• 3.2.8 叶片再生芽的生根
• 3.2.9 炼苗移栽
• 3.3 叶片遗传转化体系的初步探索
• 3.3.1 Km浓度的筛选
• 3.3.2 抑菌试验 Cef浓度的确定
• 3.3.3 侵染时间及农杆菌浓度的筛选
• 4 讨论
• 4.1 葡萄无菌系建立的影响因子
• 4.2 葡萄叶盘法再生系统建立的影响因子
• 4.3 葡萄转化体系初步探索
• 4.4 褐化是制约葡萄转基因体系建立主要因素
• 5 小结
• 参考文献
• 图版和图版说明
• 致谢
• 附录 Ⅰ