窒息法心肺脑复苏大鼠脑组织含水量和AQP4表达水平相关性研究

论文摘要

目的在心肺脑复苏（Cardiopulmonary cerebral Resuscitation CPCR）过程中，脑水肿（cerebral edema）的发生对于复苏的预后进展有着非常重要的作用，研究在心肺复苏过程中引起脑水肿的因素从而显得非常重要。各种原因所致呼吸循环骤停均可引起脑水肿，重者危及生命。对其治疗主要局限于渗透性利尿或外科减压，尚少针对脑水肿形成机制方面的治疗。新近有研究显示，水通道蛋白（aquaporin AQP）是大脑水转运的一个重要途径，它可能参与多种神经系统疾病中脑水肿的形成。水通道蛋白是对水专一的通道蛋白，普遍存在于动物植物和微生物中。它所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运，是水进出细胞的主要途径。大脑中表达的水通道蛋白主要是AQP1和AQP4，其中AQP4更为重要。已经有研究证明，AQP4参与了包括脑创伤、脑梗塞、水中毒、脑出血等疾病的脑水肿形成。但是，对于AQP4在心肺脑复苏中脑水肿中的表达和作用，目前还缺乏研究。本实验通过建立大鼠心跳呼吸骤停模型，并且进行正规的心肺脑复苏操作，然后根据复苏结果的不同，切取脑组织测量其脑组织含水量，并且进行免疫组织化学染色和免疫印迹技术检测，通过图像软件分析不同复苏结果的大鼠脑组织中的AQP-4的表达，以及进行脑组织含水量并且进行统计学分析和处理，比较不同复苏结果下脑组织含水量的不同情况，以及不同情况下脑组织中AQP-4的表达与脑组织含水量的关系，从而分析其在心肺脑复苏中的可能作用，为心肺脑复苏的分子水平研究，提供一个新的思路。研究对象与方法1、动物模型制作通过采用夹闭气管窒息的方法，建立大鼠心跳呼吸骤停模型，并且进行心肺脑复苏操作，包括体外心脏按压，呼吸机辅助通气。在实验结束后，根据不同组别（复苏成功组，复苏失败组，正常对照组），对实验动物无菌手术切取脑组织，测定脑组织含水量，多聚甲醛固定脑组织，和液氮冷冻，送检标本。2、脑组织含水量测定对于不同组别的大鼠，活体经心脏快速灌注4℃生理盐水250ml至右房流出液变清，迅速断头取脑。取左半脑，用电子天平称量湿重，80℃电热恒温干燥箱内烘烤72h，称取干重，计算脑组织含水量：BWC=[（湿重一干重）／湿重]X100％。3、免疫组化检测使用免疫组化S-P法，对切取固定的标本进行常规浸蜡，制作出蜡块，并且进行常规切片，组织材料脱蜡及水化；抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤切片；抗原修复，先后滴加一抗和二抗，滴加S—P试剂，制作切片。倒置显微镜观察AQP-4的表达。使用Imagepro-plus 6.0图像分析软件进行平均光密度检测。4、免疫印痕技术技术检测将取出的脑组织，以无菌pvc管内液氮冷冻，-70℃冰箱保存待测，预冷裂解后，超声粉碎，离心，沉淀加入溶膜缓冲液，超声混匀，冰上孵育过夜后离心，取上清分装，酚试剂法测定其蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准品。采用酚试剂法定量蛋白，检测脑组织中的AQP-4含量。5、数据处理利用ChemiImager 5500 V2.03图象分析软件对western实验结果进行分析。用spss13.0软件包对于不同组别的实验数据，采用单因素方差分析，采用p＜0.05作为差异具有显著性的标准。如果差异具有显著性，则进行LSD法检验（t检验完成值之间的两两检验），仍然以p＜0.05作为差异具有显著性的标准。用spss13.0软件包进行处理。对于脑组织含水量和AQP4的westren数据表达值，采用直线相关分析，以p＜0.05作为差异显著性标准。实验结果1、实验动物的生命体征情况心肺复苏各组大鼠窒息至开始心肺复苏的指标一致，经过统计学分析提示其差别不具有显著性（p＞0.05），提示自主循环恢复之前复苏各组大鼠所遭受到的缺血缺氧性损害程度是基本相同的。2、脑组织含水量测定结果对于复苏成功组和对照组，其脑组织含水量（％）（成功组77.72±0.24，对照组77.74±0.08）差异不具有显著性（p＞0.05），对于复苏成功组（77.72±0.24）和失败组（80.51±0.35）之间，以及复苏失败组（80.51±0.35）和对照组（77.74±0.08）之间，其差异具有显著性（p＜0.05）。3、免疫组化结果通过免疫组化，倒置显微镜镜下观察到AQP4在心肺脑大鼠中，其在复苏成功组和对照组中的表达相类似，此二者的表达明显少于在复苏失败组中的表达。而通过图像分析系统也提示此二者表达明显少于在复苏失败组中的表达。4、免疫印痕技术结果通过免疫印痕技术分析，获得其灰度值后，进行方差分析，提示存在组间差异（F=246.672 p＜0.05），比较不同组别间的差异，通过LSD统计学分析表明，AQP4的在复苏成功组中的表达明显少于复苏失败组（p＜0.05），而与对照组（正常健康大鼠）的表达类似（p=0.702＞0.05）。5、脑组织含水量和脑组织AQP4表达的相关性分析二者之间通过相关性分析，可以发现此二者存在相关关系（K=1.54b=20.52 r=0.872 p＜0.05）实验结论1、脑组织含水量检测证实复苏失败组的脑组织含水量明显高于正常对照组和复苏成功组，其差异具有显著性，提示复苏失败大鼠的脑水肿比较明显。2、免疫组化的结果可以看出，心肺脑复苏成功组的大鼠的脑组织中，AQP4的表达不明显，与正常对照组（正常健康大鼠）的表达类似，而在复苏失败组的大鼠中，其表达非常明显。对于图像分析系统的平均光密度值，进行统计学分析提示复苏成功组与失败组之间，对照组和失败组之间AQP4表达差异存在显著性（p＜0.05），而复苏成功组和对照组之间差异不具有显著性（p＞0.05）。3、免疫印迹技术的结果进一步证实了上述结论，水通道蛋白—4在心肺脑复苏中在失败的病例中表达明显，而在复苏成功和正常对照组中的表达不明显。4、脑组织含水量测定和脑组织AQP4的表达水平相关性结果表明，二者之间存在相关关系，呈现线性相关，即在脑组织含水量增加时，AQP4的表达水平也随之上升，说明脑水肿可能是AQP4的表达所引起。结论：AQP4在心肺脑复苏失败大鼠脑组织中表达明显，与脑水肿程度正相关提示AQP4在心肺脑复苏中对脑组织有损害作用，可能和引起脑水肿有关。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论文摘要
• 英文论文摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 四、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介