论文题目: 白念珠菌基因芯片的制备和应用及两个新基因的克隆和功能鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 药理学
作者: 徐铮
导师: 姜远英
关键词: 白念珠菌,基因芯片,耐药性,新基因,功能
文献来源: 第二军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: 白念珠菌是临床免疫功能低下患者最为常见的致病真菌,常造成粘膜和深部真菌感染。我们利用SMART技术快速构建了白念珠菌高比例全长cDNA文库,并制备了含有3096个unigene的白念珠菌cDNA微阵列芯片。利用所构建的基因芯片我们研究了共六对氟康唑敏感和耐药白念珠菌配对菌株的大规模基因表达谱,证实不同环境下产生的白念珠菌耐药性均与多药耐药基因CDR的mRNA表达增加有关,并从中鉴定了一些与药物耐受性相关的共同差异表达基因和一些有趣的功能连锁基因群。同时,通过比较耐药和敏感菌株之间的差异,我们从大量差异表达基因中筛选出两个耐药相关新基因,在详尽生物信息学分析的基础上,获得新基因的完整编码序列并从敏感性,外转运,细胞周期,及形态毒力等几方面对其功能进行了系统研究。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
缩写
前言
第Ⅰ部分 构建高比例全长cDNA文库制备白念珠菌基因芯片
一、实验材料与方法
1.1.1 白念珠菌和生长条件
1.1.2 药物和敏感性测定
1.1.3 cDNA文库构建
1.1.4 全长性检测
1.1.5 质粒抽提和大规模测序
1.1.6 生物信息学处理
1.1.7 微阵列制备
1.1.8 RNA提取和探针标记
1.1.9 芯片杂交和质检
二、结果
1.2.1 总RNA提取和mRNA分离
1.2.2 LD-PCR产物分析
1.2.3 cDNA片段分析
1.2.4 库容量和重组率计算
1.2.5 重组子插入片段长度分析
1.2.6 全长cDNA鉴定
1.2.7 EST序列归并
1.2.8 基因组比较
1.2.9 Unigene功能分类
1.2.10 芯片杂交质量分析
三、讨论
第Ⅱ部分 利用基因芯片研究不同耐药机制白念珠菌的基因表达谱
一、实验材料与方法
2.1.1 菌株和培养基
2.1.2 药物和敏感性测定
2.1.3 RNA提取和探针标记
2.1.4 芯片杂交
2.1.5 芯片检测和分析
2.1.6 聚类分析
2.1.7 cDNA合成和RT-PCR
二、结果和讨论
2.2.1 芯片杂交总体实验设计
2.2.2 ABC转运蛋白和MFS转运蛋白家族基因
2.2.3 耐药相关基因的DRE元件及TAC1与DRE的相互作用
2.2.4 氧化应激相关基因和线粒体功能
2.2.5 铜、铁离子转运和动员相关基因
2.2.6 形态和毒力相关基因
2.2.7 聚类分析
三、小结
第Ⅲ部分 耐药相关全长新基因的克隆和生物信息学分析
一、实验材料与方法
3.1.1 白念珠菌株和培养基
3.1.2 DNA测序和Walking
3.1.3 CaHXT10和CaFDH12的克隆
3.1.4 生物信息学分析
二、结果
3.2.1 全长基因的获取
3.2.2 CaHXT10和CaFDH12的核酸结构和染色体定位分析
3.2.3 CaHXT10和CaFDH12的蛋白质序列分析
3.2.4 全长新基因进化树亲缘分析
3.2.5 全长新基因的芯片数据分析
三、讨论
第Ⅳ部分 全长新基因CaHXT10和CaFDH12的功能鉴定
一、实验材料与方法
4.1.1 CaHXT10和CaFDH12高表达载体的构建
4.1.2 DNA测序和序列分析
4.1.3 白念珠菌高表达株和生长条件
4.1.4 白念珠菌转化
4.1.5 RNA提取
4.1.6 cDNA合成和逆转录PCR(RT-PCR)
4.1.7 实时荧光定量PCR(RealTime-PCR)
4.1.8 SDS-PAGE变性凝胶电泳
4.1.9 微量液基稀释法测定药物敏感性
4.1.10 琼脂平板抑菌圈实验
4.1.11 时间生长曲线研究
4.1.12 流式细胞术测定细胞周期
4.1.13 细胞形态观察
4.1.14 激光共聚焦显微镜观察
4.1.15 Rhodamine 6G的荧光外排实验
4.1.16 体内毒力研究
二、结果
4.2.1 高表达载体的构建并确证
4.2.2 高表达菌株的构建并确证
4.2.3 CAI4-HXT10和CAI4-FDH12高表达菌的药物敏感性
4.2.4 CaFDH12和CaHXT10基因高表达对白念珠菌生长曲线的影响
4.2.5 CaFDH12基因高表达对细胞周期的影响
4.2.6 CaFDH12和CaHXT10基因高表达对罗丹明的摄取和外排作用
4.2.7 CaFDH12和CaHXT10基因高表达对白念珠菌菌丝形成的影响
4.2.8 CaFDH12和CaHXT10基因高表达对白念珠菌生物膜形成的影响
4.2.9 CAI4-FDH12和CAI4-HXT10高表达菌对小鼠的体内毒力实验
三、讨论
总结
参考文献
附录：综述一、二
发表文章
致谢
发布时间: 2005-07-19
参考文献
- [1].白念珠菌ORF19.273和FLO8基因在耐药与宿主免疫中的功能和机制研究[D]. 吕权真.中国人民解放军海军军医大学2018
- [2].miR-155在树突状细胞抗白念珠菌固有免疫应答中的调节作用及其机制研究[D]. 魏婷婷.中国人民解放军海军军医大学2018
- [3].白念珠菌生物被膜形成相关基因的功能研究[D]. 曹颖瑛.第二军医大学2005
- [4].白念珠菌多药耐药蛋白Cdr1p构效关系研究[D]. 高平挥.第二军医大学2006
- [5].EAP2的双稳态表达主控白念珠菌白—灰形态的转换[D]. 黄广华.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2006
- [6].念珠菌胞壁葡聚糖某些结构、活性及分类鉴定意义的研究[D]. 李岷.中国协和医科大学1999
- [7].白念珠菌烯醇化酶的研究[D]. 唐宁枫.中国协和医科大学2000
- [8].白念珠菌菌相转换基因HYR1启动子活性研究[D]. 陈江汉.第二军医大学2006
- [9].小鼠口腔阴道双部位白念珠菌感染模型的构建及不同部位来源白念珠菌的毒力差异研究[D]. 王乐.北京协和医学院2014
- [10].ADH1基因与白念珠菌耐药性和致病力的相关性研究[D]. 宋延君.暨南大学2017
相关论文
- [1].白念珠菌耐药相关蛋白Rta2p的生物功能及分子机制研究[D]. 贾鑫明.第二军医大学2008
- [2].白念珠菌耐药基因CDR1基因表达调控机制的初步研究[D]. 贺志彬.第二军医大学2003
- [3].深部念珠菌的基因诊断、分子分型及耐药机制研究[D]. 李劲松.天津医科大学2004
- [4].转录因子Caplp促进白念珠菌抗药性形成的分子机制研究[D]. 曹永兵.第二军医大学2004
- [5].白念珠菌细胞周期及抗真菌中药单体对其影响的研究[D]. 吴建华.第二军医大学2003
- [6].HBV基因芯片的制备及其在临床应用的研究[D]. 何群.中国医科大学2005
- [7].白念珠菌生物被膜形成相关基因的功能研究[D]. 曹颖瑛.第二军医大学2005
- [8].Cap1p和活性氧参与白念珠菌耐药性产生的机制研究[D]. 王彦.第二军医大学2006
- [9].小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用及作用机制研究[D]. 权华.第二军医大学2006
- [10].白念珠菌多药耐药蛋白Cdr1p构效关系研究[D]. 高平挥.第二军医大学2006