论文摘要
L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和动物不能自身合成的必需氨基酸之一,广泛应用于制药、食品等多个领域。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体,以它为载体,可以把抗肿瘤药物的分子或基团载入肿瘤区,达到既能抑制肿瘤生长又能降低原肿瘤药物毒性的目的。L-苯丙氨酸还可抑制心肌成纤细胞的增生,为防治高血压提供新的方法。研究证明L-苯丙氨酸在抗肿瘤、抗癌等方面有显著作用,具有广阔的发展前景。L-苯丙氨酸最主要的用途是作为食品添加剂阿斯巴甜合成的原料。阿斯巴甜是由苯丙氨酸和天门冬氨酸合成的,甜度为蔗糖的200倍,热量是等量蔗糖的1/200。阿斯巴甜广泛应用于食品和医药工业。人们食用后,阿斯巴甜由人体的酶分解转化为氨基酸,被人体吸收后,对人体有营养保健功能。另外,人们食用阿斯巴甜,其残留部分不会转化为乳酸,因此,对人们的牙齿没有腐蚀作用。对预防龋齿病,特别是对儿童的健康有益。还有一重要有点,阿斯巴甜适合糖尿病人食用,因它不需胰岛素介入分解,不会增加血糖。总之,阿斯巴甜适用于糖尿病、高血压、心脏病、肥胖症患者。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是通过转氨作用合成L-苯丙氨酸,它不但作为工具酶用L-苯丙氨酸的制备,而且本身具有一定的药用价值,用于治疗实验鼠的某些肿瘤,进行血清L-苯丙氨酸的定量酶法分析,苯丙酮尿症的诊断和治疗时效果明显。研究表明PAL在抑制某些肿瘤细胞效果显著。PAL可迅速抑制癌变细胞DNA和蛋白质的合成及细胞的分裂和生长,对正常细胞影响不大。机理可能是PAL降解L-苯丙氨酸从而降低肿瘤细胞生长所必需的氨基酸,使肿瘤细胞因“饥饿”而停止生长,达到抑制肿瘤生长的目的。现临床上用脂质体包被PAL,可提高酶的催化效率,延长半衰期,降低免疫原性,达到更理想的治疗效果。PAL广泛分布在高等植物、真菌、酵母菌和唯一的原核生物-链霉菌中。然而,在动物中尚未发现有该酶存在。PAL在高等植物内,是次生代谢的关键酶和限速酶,在植物防御方面起着重要作用。在微生物体内,PAL使得微生物可以利用L-苯丙氨酸做为唯一碳源。PAL在酵母菌尤其是红酵母家族含量最为丰富。本文选择Rhodosporidiumpaludigenum作为研究材料,对其形态特征、生理生化特征、核糖体转录间隔区（intergenicspacer region,ITS）序列分析,不同物质对产PAL的影响以及诱变育种作了研究。并且对菌株JM432产PAL基因的全长cDNA序列进行克隆。在形态特征和生理生化特征分类的基础上,通过分子生物学方法对PAL产生菌JM432进行了分类鉴定。菌株形态、培养特征,部分生理生化反应研究表明菌株JM432具有红色酵母的形态特点,不发酵任何糖,无合成类淀粉化合物的能力,利用硝酸钾迅速而强烈。测定和分析了菌株的18S-26S rRNA ITS序列。研究结果表明,菌株JM432为红冬孢酵母属中的Rhodosporidium paludigenum。通过单因素实验,研究了L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸,铵根离子,无机盐,微量元素对PAL活力的影响。结果表明,在培养基中添加诱导物对PAL的影响不大,当L-苯丙氨酸浓度为0.1%时,PAL活力仅为对照的123.04%;L-异亮氨酸浓度为0.1%时,PAL的活力为对照的121.25%;L-酪氨酸抑制PAL的合成;无机盐-铁离子对PAL有激活作用,酶活力达到对照的192.17%;在培养基中添加0.1%的硫酸铵,PAL活力为对照的258.56%;微量元素-铜离子对PAL的影响最大,酶活力为对照的384.56%。以JM432作为实验出发菌株:制备菌悬液,加入8-MOP（甲氧基补骨质素,methoxy-psoralen）黑暗中放置30分钟。8-MOP是一种光敏试剂,8-MOP与长波紫外线复合可以产生诱变效应,常用于治疗某些皮肤病。将8-MOP应用于PAL的突变株筛选目前尚未有报道。紫外灯下照射诱变,红光下涂布筛选平板。本研究采用的筛选方法是类似物筛选系统。L-苯丙氨酸是PAL的作用底物,可以诱导酶的合成。L-酪氨酸是L-苯丙氨酸的结构类似物,是PAL的不良底物,即Km值较高。酵母菌要在这种结构类似物存在时较好地生长,只能合成更多的PAL。通过类似物筛选系统,获得了大量的突变株,进而从中筛选到PAL活力提高90%以上,遗传稳定性良好的高产菌株ZW115。同时筛选到一株37℃下生长良好,PAL活力提高二倍（与相同培养条件下的出发菌株相比较）,遗传稳定性良好的高产菌株NR128。对突变株ZW115,NR128每日PAL活力进行了研究,其中ZW115和NR128的酶活峰均出现在72小时,PAL活力分别是原始菌株的0.94倍,2.23倍。尽管对酵母产PAL的分子生物学研究取得了一些进展,一些酵母完整的PAL基因已经获得并测序,但是有关Rhodosporidium paludigenum的完整cDNA序列目前尚不清楚。为了获得PAL基因的全长cDNA序列,本研究根据Genbank上的红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）PAL蛋白,胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）PAL蛋白,粘红酵母（Rhodotorula glutinis）PAL蛋白的氨基酸序列同源比对结果,选取同源性比较高的区段设计简并引物,优化设计了一对简并引物。在设计简并引物时,选择同源性相对较低而不是最高的氨基酸序列,另外采用次黄嘌呤核苷酸代替简并引物中的N,使其简并度降低到96/64,两者的退火温度更加接近。在实验中采用热启动和逐渐升温PCR技术,成功地扩增出一条650bp的cDNA片段。为了取得JM432 PAL cDNA基因的3′端序列,采用RACE-PCR技术,根据上述已取得的中间序列设计合成一条基因特异性引物,反转录反应中采用oligo-d（T）接头引物合成第一链cDNA,扩增反应中用基因特异性引物和通用接头引物进行扩增。通过3′RACE-PCR技术延伸了PAL基因的cDNA序列,获得650bp的3′端序列。在5′端序列的克隆中,同样根据已取得的中间序列设计两对基因特异性引物A1、S1,A2、S2以及末端磷酸化的反转录引物。用末端磷酸化的反转录引物在反转录酶（reverse transeriptase,RT）作用下反转录总RNA得到第一链cDNA,然后使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA链,用T4 RNA连接酶将单链cDNA环化形成首尾连接物。进行PCR扩增时,第一轮扩增用基因特异性引物A1和S1,第二轮扩增采用巢式PCR,以第一轮PCR产物为模板,利用基因特异性引物A2和S2扩增出未知mRNA的5′端。通过5′RACE-PCR技术延伸了PAL基因的cDNA序列,获得了大约1800bp的5′端序列。将RACE-PCR技术获得的PAL基因的3′端序列和5′端序列进行拼接,得到2.3kb的JM432 PAL全长cDNA序列。根据此序列设计一对引物,采用LD-PCR技术扩增PAL全长cDNA序列。初步验证所得序列即为JM432所产PAL全长cDNA序列。