烟草中与RNA干扰抑制子HC-pro互作蛋白的鉴定

论文题目: 烟草中与RNA干扰抑制子HC-pro互作蛋白的鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 靳永胜

导师: 王涛

关键词: 干扰,酵母双杂交,锌指结构蛋白,免疫共沉淀

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 马铃薯Y病毒的HC-pro蛋白是一个抑制能力很强的RNA干扰抑制子。为研究HC-pro蛋白抑制RNA干扰的分子机制,我们试图利用马铃薯Y病毒的HC-pro为诱饵蛋白,通过酵母双杂交从烟草cDNA文库中筛选出与RNA干扰有关的蛋白因子。利用Clontech公司的酵母双杂交试剂盒,在宿主菌AH109中,通过酵母菌的自我重组把烟草叶片的cDNA文库构建在cDNA文库载体pGADT7-Rec上;把HC-pro的cDNA连接到载体pGBKT7上构建成诱饵载体,然后转化到酵母菌Y187中。把含有cDNA文库的酵母菌AH109与含有诱饵载体的酵母菌Y187进行交配,把交配后的菌液直接涂布到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上进行筛选。通过两轮四缺培养基筛选和α-X-半乳糖苷酶活性检测,共有136个克隆显示α-X-半乳糖苷酶活性。在这136个克隆中,共测出120个cDNA的序列,编码21个蛋白因子。将这21个cDNA质粒与诱饵质粒pGBKT7-HC-pro一起共转化到酵母菌AH109中,在四缺培养基上作进一步的筛选和α-X-半乳糖苷酶活性检测,有20个cDNA质粒表现互作阳性,分别命名为SZ1—SZ20。通过核苷酸和氨基酸序列比较,发现除了2个未知功能蛋白外,其余的互作阳性因子大致可分为4类:一类是参与植物光合作用和碳水化合物代谢的蛋白,如:参与叶绿体分裂的ParA家族的ATPase、参与三羧酸循环的转酮醇酶、参与TCA循环乌头酸酶、多糖磷酸化酶和果糖激酶;第二类是一些与植物抗逆有关的因子,有山梨醇脱氢酶、真菌及伤口诱导蛋白BARWIN、过氧化氢酶catalose以及半胱氨酸蛋白酶等;第三类是参与基因转录、翻译和蛋白代谢的蛋白因子,有多锌指结构蛋白、20S Proteasome beta亚基、DNA聚合酶家族蛋白等;第四类是有关氨基酸和氮代谢的酶,有天冬氨酸蛋白酶、谷氨酰胺合成酶、胺氧化酶、丝氨酸/苏氨酸脱氢酶等。挑选互作阳性相对较强的SZ1和SZ2 cDNA质粒作为重点研究。 通过5’RACE得到了SZ1的5’端,并通过RT-PCR扩增出了SZ1的cDNA全长。SZ1是一个多锌指结构蛋白,含有8个CCHC锌指结构,N端是连续的RS序列,在第7和第8个锌指结构之间有一个RGG框。另外,SZ1还有一个异构体,在近N端缺失6个氨基酸(16-21),第7位由半胱氨酸变为甘氨酸,第35位由天冬氨酸变为组氨酸。 利用与SZ2核苷酸序列高度同源的番茄基因的核苷酸序列设计出5’端引物,用SZ2的cDNA设计出3’端引物,通过RT-PCR扩增SZ2 cDNA全长,核苷酸和氨基酸序列比对结果表明:SZ2是20S Proteasome蛋白酶复合体的beta亚基。 将SZ1和SZ2的cDNA分别与HC-pro的cDNA一起连接到免疫共沉淀载体pESC-Leu上,然后转化酵母菌株INVScI,经过D-半乳糖诱导表达后,提取酵母菌总蛋白进行免疫共沉淀。实验结果表明,SZ1和SZ2都能与HC-pro蛋白互作。 把SZ1和SZ2分别连接到原核表达载体pMAL-c2x和pET30a上,构建原核表达载体pMAL-c2x-SZ1和pET30a-SZ2,在大肠杆菌中都能诱导表达,并在非变性条件下纯化得到了可溶性蛋白。 SZ1和SZ2与植物RNA干扰之间的联系正在继续研究。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述

1.1 RNA沉默的机制

1.1.1 小RNA的种类

1.1.2 Dicer蛋白与siRNA和microRNA的产生

1.1.3 AGO蛋白和沉默效应子复合体的形成

1.1.4 RNA干扰介导的转录基因沉默

1.1.5 沉默信号的扩增与传递

1.1.6 RNA干扰的遗传调控

1.1.7 目前已发现的参与siRNA和miRNA途径的细胞因子

1.2 病毒编码的基因沉默抑制子的研究

1.2.1 病毒编码的RNAi抑制子的发现及其多样性

1.2.2 病毒RNAi抑制子作用的分子机制

1.2.3 马铃薯Y病毒基因沉默抑制子HC-pro作用的分子机制研究

1.2.4 其它的一些基因沉默抑制子的抑制机制

1.3 本研究的目的和意义

第二章 烟草中与马铃薯Y病毒Hc-PRO蛋白互作的蛋白因子筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 所用引物

2.2 实验方法

2.2.1 酵母操作所需培养基和试剂的配制

2.2.2 诱饵载体的构建

2.2.3 烟草cDNA表达文库的构建

2.2.4 酵母杂交和互作子的筛选

2.2.5 cDNA文库质粒与诱饵质粒在酵母中互作再验证

2.3 结果与分析

2.3.1 pGBKT7-Hcpro诱饵载体的构建验证

2.3.2 烟草总RNA提取

2.3.3 双链cDNA文库的扩增

2.3.4 杂交结果

2.3.5 cDNA序列在NCBI上的同源性比较结果

第三章 SZ1和SZ2CDNA全长的克隆及序列分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 SZ15’端的RACE

3.2.2 SZ1的拼接序列

3.2.3 SZ1全长的克隆

3.2.4 SZ2的cDNA全长克隆

第四章 核酸结合蛋白SZ1和20s PROTEASOUE BETA亚基SZ2与HC-PRO的免疫共沉淀研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 基因互作载体的构建

4.1.3 SZ1和SZ2分别与HC-pro蛋白的免疫共沉淀

4.2 结果与分析

4.2.1 SZ1和SZ2分别与HC-pro所构成的互作载体的酶切验证

4.2.2 SZ1和SZ2的免疫共沉淀

第五章 SZ1和SZ2的原核表达

5.1 材料和方法

5.1.1 材料

5.1.2 原核表达载体的构建

5.1.3 融合蛋白的原核诱导表达

5.1.4 融合蛋白的纯化

5.2 结果和分析

5.2.1 两个原核表达载体的酶切验证

5.2.2 蛋白的诱导表达

5.2.3 融合蛋白的纯化

第六章 讨论与结论

6.1 讨论

6.1.1 RNA干扰抑制子HC-pro抑制RNA干扰的可能作用位点

6.1.2 SZ1的蛋白结构与参与RNA干扰的可能途径探讨

6.1.3 HC-pro与20S proteasome的互作和影响RNA干扰的可能途径探讨

6.1.4 酵母双杂交假阳性的控制

6.2 结论

参考文献

缩略词

作者简介

致谢

发布时间: 2006-04-05

参考文献

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