小鼠KASH蛋白Syne-1,Syne-2和SUN蛋白SUN1,SUN2在肌肉细胞核锚定和神经细胞迁移过程中的功能研究

论文摘要

细胞核的正常定位在多种生物学过程中起着重要作用,在人体内细胞核定位的失败能够导致严重疾病。细胞骨架微管和肌动蛋白都参与了细胞核定位的过程。近年来在线虫和果蝇中的研究表明,KASH/SUN两类核膜蛋白通过与不同细胞骨架的作用在细胞核的迁移和锚定中起着重要功能。虽然在体外培养的细胞中对哺乳动物中的KASH蛋白和SUN蛋白有一定的研究,但是两类核膜蛋白在小鼠体内的功能在很大程度上仍不清楚。本研究中,我们运用KASH蛋白Syne-1,Syne-2和SUN蛋白SUN1,SUN2的基因敲除小鼠,探讨了这四个基因在小鼠肌肉细胞核锚定和神经细胞迁移过程中的功能。在哺乳动物的骨骼肌中,成百上千的细胞核均匀排布在细胞膜下方,仅在神经肌肉接头下有3—8个细胞核聚集（突触下细胞核）。虽然肌细胞核的特征性分布被认为有利于细胞质转运和维持神经肌肉接头的结构,但是其定位机制一直以来有待发掘。我们发现,Syne-1,Syne-2和SUN1,SUN2在肌肉中都定位在细胞核膜上。Syne-1的KASH功能域被敲除之后破坏了突触外肌细胞核的定位和突触下细胞核的聚集,后者进一步影响了与之相连的运动神经的正常发育。在肌肉中过量表达带有KASH功能域的Syne-2蛋白片段后能够干扰内源Syne-1蛋白的功能,从而破坏了突触下细胞核的锚定。SUN1和SUN2分别单独被敲除后对肌细胞核的定位没有影响,但是二者同时被敲除之后同样能够破坏肌肉细胞核的定位和运动神经的发育,而且二者在Syne-1的核膜定位中起着必须的且相互冗余的功能。上述结果表明Syne-1和SUN1,SUN2一起在肌细胞核的锚定中起着关键作用。神经细胞迁移失败是导致多种严重人类疾病的重要原因,比如癫痫,智力发育异常和精神分裂症。细胞核迁移是神经细胞迁移过程中的关键步骤。核迁移中,微管和胞质动力蛋白是如何将迁移动力施加到细胞核的一直是一个非常重要的问题。我们发现,Syne-1,Syne-2双敲除（Syne DKO）小鼠和SUN1,SUN2双敲除（SUN DKO）小鼠在出生后都因无法呼吸而很快死亡,而且两种双敲除小鼠的大脑显著变小。组织学分析发现,两种双敲除小鼠的皮层发育严重受损,无法正常分层。细胞迁移追踪实验结果表明,Syne-1,Syne-2双敲除和SUN1,SUN2双敲除分别造成了辐射方向神经细胞迁移的失败。结合Syne和SUN蛋白在核膜上与胞质动力蛋白和Lis1的定位关系,我们提出Syne-1,Syne-2和SUN1,SUN2很可能提供了胞质动力蛋白在细胞核膜上的锚定位点,从而介导微管系统向细胞核施加的迁移动力。我们对Syne-1,Syne-2和SUNl,SUN2在小鼠体内的生物功能研究揭示了它们在至少两类细胞核定位中的重要作用,即骨骼肌细胞核的锚定和大脑皮层神经元的辐射方向迁移。本研究的结果不仅丰富了对细胞核锚定和迁移的分子机制的研究,而且增进了对肌无力和神经系统病症等人类疾病发病机理的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言:细胞核的迁移和锚定
• 1.1 真核生物的细胞核
• 1.1.1 真核细胞的结构
• 1.1.2 细胞核的结构和在细胞内的定位
• 1.2 研究细胞核定位的生物模型
• 1.2.1 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
• 1.2.2 构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
• 1.2.3 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）
• 1.2.4 黑腹果蝇（Drosophila Melanogaster）
• 1.2.5 哺乳动物:细胞核迁移的研究及其重要意义
• 1.3 细胞核定位研究小结:细胞骨架和分子马达在细胞核定位中的重要作用
• 1.3.1 细胞核的迁移
• 1.3.2 细胞核的锚定
• 第二章 Syne-1和Syne-2在肌肉细胞核锚定和运动神经发育中起着重要作用
• 2.1 背景知识
• 2.1.1 KASH蛋白的发现和在低等生物中的研究
• 2.1.2 哺乳动物中的KASH蛋白
• 2.1.3 小鼠肌肉细胞的发育以及肌细胞核的排布
• 2.1.4 选题的目的和意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 Syne-1和Syne-2打靶质粒的构建
• 2.2.2 MCK-Syne-2转基因小鼠的培育
• 2.2.3 胚胎干细胞的培养
• 2.2.4 胚胎干细胞电击转染和同源重组克隆的筛选
• 2.2.5 ES细胞的核型分析
• 2.2.6 嵌合体小鼠的培育
• 2.2.7 基因组DNA的抽提和Southern杂交
• 2.2.8 Syne-1,Syne-2和SUN2蛋白特异性抗体的制备和纯化
• 2.2.9 组织切片
• 2.2.10 苏木精—伊红（HE）染色
• 2.2.11 免疫荧光染色
• 2.2.12 电生理实验
• 2.2.13 引物列表
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Syne-1,Syne-2蛋白KASH功能域敲除小鼠的培育和鉴定
• 2.3.2 Syne-1基因敲除破坏了突触外肌肉细胞核的均匀定位
• 2.3.3 Syne-1基因敲除破坏了神经肌肉接头下肌肉细胞核的锚定
• 2.3.4 Syne-2敲除后不影响肌细胞核定位但Syne-2过表达干扰了肌细胞核锚定
• 2.3.5 Syne-1;Syne-2双敲除小鼠无法呼吸,出生后很快死亡
• 2.3.6 Syne-1敲除后导致运动神经末端分支显著变长
• 2.3.7 Syne基因敲除对神经肌肉接头发育中关键分子的表达未造成显著影响
• 2.3.8 Syne基因双敲除并未显著影响神经肌肉接头的信号传输
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 SUN1和SUN2在肌肉细胞核锚定中的功能
• 3.1 背景知识
• 3.1.1 SUN蛋白的发现
• 3.1.2 SUN蛋白多样的分布和功能
• 3.1.3 SUN蛋白与KASH蛋白相互作用
• 3.1.4 选题的目的和意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 SUN2基因打靶载体的构建
• 3.2.2 SUN2基因敲除小鼠基因型鉴定所用引物列表
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SUN1和SUN2都在小鼠肌肉中表达并且定位在细胞核膜上
• 3.3.2 SUN1或SUN2分别被敲除后不影响肌细胞核的定位
• 3.3.3 SUN1和SUN2同时被敲除后破坏了肌肉细胞核的定位
• 3.3.4 SUN双敲除后影响了膈神经的发育
• 3.3.5 SUN双敲除破坏了Syne-1的细胞核膜定位
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 Syne-1,Syne-2和SUN1,SUN2在神经细胞迁移中的功能
• 4.1 背景知识
• 4.1.1 大脑皮层的结构
• 4.1.2 大脑皮层的发育和神经细胞的迁移
• 4.1.3 神经细胞迁移过程的细胞核迁移（Nucleokinesis）
• 4.1.4 胞质动力蛋白/Lis1复合体和细胞核迁移
• 4.1.5 细胞核膜与细胞核迁移
• 4.1.6 选题的目的和意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 利用BrdU对神经细胞迁移示踪
• 4.2.2 胚胎鼠脑的组织学处理
• 4.2.3 胚胎小鼠大脑皮层细胞的原代培养
• 4.2.4 抗体列表
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 SUN双敲除小鼠的脑显著变小并存在多种缺陷
• 4.3.2 SUN双敲除小鼠大脑皮层的分层缺陷
• 4.3.3 SUN双敲除导致小鼠皮层神经细胞辐射方向迁移失败
• 4.3.4 Syne双敲除小鼠的大脑表现出与SUN双敲除小鼠相似的缺陷
• 4.3.5 Syne-1/2和SUN1/2在神经细胞中的定位
• 4.3.6 SUN1/2的缺失导致Syne-2无法正常定位到核膜上
• 4.3.7 Syne-1/2与Lis1和动力蛋白共定位
• 4.4 小结和展望
• 参考文献
• 在学期间发表的文章
• 致谢