饥饿条件下细胞自吞噬与mTOR的负反馈调节机制研究

论文摘要

本研究在细胞生长中心调控因子mTOR与自吞噬（autophagy）、mTOR与氨基酸以及自吞噬与氨基酸的已有研究基础上,进一步探索其三者之间可能的相互调节网络,主要关注以下四个问题：1.饥饿条件下,mTOR的重新激活与自吞噬降解产生的胞内氨基酸和胞外氨基酸的关系；2.氨基酸转运体在饥饿条件下mTOR被重新激活中的作用；3.mTOR的活性变化对氨基酸转运体表达量的调节；4. mTOR和自吞噬过程在饥饿应激条件下对细胞存活的影响。本研究旨在进一步阐明mTOR,自吞噬和氨基酸三者之间的关系以及调节机制,为该方面的研究提供相应的理论基础和思路。试验内容主要包括三部分：（1）由于Beclinl为自吞噬发生所必需的,本试验首先构建Beclinl基因抑制的自吞噬受损稳定细胞系,然后分别通过Western Blot和免疫荧光检测血清饥饿和DPBS饥饿条件下,正常NRK细胞和Beclinl基因抑制细胞不同饥饿时间点mTOR的活性和自吞噬体形成的数量变化。（2）对比血清饥饿和DPBS饥饿条件下mTOR的活性变化,验证氨基酸转运体在血清饥饿条件下对mTOR活性的调节作用,以及mTOR的活性对氨基酸转运体表达量的影响。（3）检验影响mTOR和自吞噬活性状态的不同处理对细胞存活的影响,以及Bcl2在其中的作用。研究结果如下：（1）正常NRK细胞血清饥饿4h时,mTOR的下游蛋白S6K的磷酸化水平呈极显著降低（P<0.01）,随饥饿时间的延长,S6K的磷酸化水平呈极显著升高（P<0.01）,呈现规律而明显的波动变化；同样处理条件下,血清饥饿4h时自吞噬体的个数即呈极显著增加（P<0.01）,饥饿14h时自吞噬体个数呈现极显著下降（P<0.01）,与mTOR的活性变化类似都表现为明显的波动变化,但不同的是,自吞噬发生的高峰期在mTOR的活性重新上调之前；然而在自吞噬受损的Beclinl基因抑制稳定细胞系中,采取同样的试验条件和方法,结果发现,该细胞系中mTOR的活性不能随饥饿时间的延长被重新激活。（2）对比血清饥饿和不含氨基酸的DPBS饥饿条件,结果发现血清饥饿组S6K的磷酸化水平呈规律而明显的波动变化,而DPBS组3h时S6K的磷酸化水平同样呈极显著下降（P<0.01）,但随饥饿时间的延长,S6K的磷酸化水平同Beclinl基因抑制稳定细胞系类似都没出现回升；试验通过浓度梯度鉴定2.5mM GPNA和50mM BCH为本试验中可明显抑制氨基酸转运体SLC1A5和SLC7A5的合适浓度,添加GPNA的试验组与对照组相比,血清饥饿8h时,S6K的磷酸化水平没有回升的迹象与对照组相比差异极显著（P<0.01）,BCH处理时S6K的磷酸化水平表现出GPNA处理时类似的趋势；血清饥饿16h时氨基酸转运体SLC7A5的表达量表现为极显著上调（P<0.01）,当RAPA或GPNA处理抑制饥饿条件下mTOR的重新激活时,SLC7A5的表达量虽有上调,但与对照组相比效果微弱,差异极显著（P<0.01）。试验采用同样的方法检测氨基酸转运体SLC7A8的变化,结果与对照组相比没有显著差异。（3）试验通过比较血清饥饿条件下正常NRK细胞、NRK+RAPA、Beclin1 KD稳定细胞、Beclin1 KD+RAPA四种处理对细胞存活率的影响,饥饿50h时,四种处理下细胞的存活率分别为120%、80%、50%和40%,差异明显,自吞噬和mTOR受损都加速细胞死亡；通过Western Blot检测发现饥饿3h时NRK细胞的Bcl2表达量呈极显著下降（P<0.01）,随饥饿时间的延长,于21h时呈极显著升高（P<0.01）；在Beclin1 KD细胞中过表达Bcl2,可明显降低细胞的死亡率。本试验结果表明：饥饿条件下,mTOR和自吞噬的活性都呈现规律性波动变化,且mTOR的重新激活是自吞噬和胞外氨基酸依赖的；氨基酸转运体通过介导胞外氨基酸进入胞内作用mTOR而间接影响mTOR的活性,同时mTOR的活性也调节氨基酸转运体的表达；饥饿应激条件下mTOR和自吞噬过程的相互调节,维持着二者的平衡,并可避免营养缺失条件下细胞的死亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一部分 文献综述
• 1.1 细胞自吞噬研究进展
• 1.1.1 细胞自吞噬的概念
• 1.1.2 细胞自吞噬发生的生物学过程
• 1.1.3 自噬体的核心分子构成元件
• 1.2 细胞自吞噬调控的分子机制研究进展
• 1.2.1 磷脂酰肌醇-3激酶复合物对自吞噬的调节
• 1.2.2 mTOR对自吞噬的调节
• 1.2.3 氨基酸转运体在氨基酸对mTOR调控中的作用
• 1.3 正常大鼠肾细胞（NRK）
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细胞系、菌种、载体与质粒
• 2.1.2 主要药品及试剂
• 2.1.3 主要培养基及其配制
• 2.1.4 SDS-PAGE缓冲液
• 2.1.5 其它缓冲液
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.2 质粒的转化
• 2.2.3 质粒的大量制备（试剂盒）
• 2.2.4 BCA法测定蛋白质浓度
• 2.2.5 SDS-PAGE/Western Blot
• 2.2.6 免疫荧光（爬片法）
• 2.2.7 NRK细胞培养
• 2.2.8 质粒转染细胞
• 2.2.9 Beclin1基因敲低稳定细胞系构建
• 2.2.10 统计学方法
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 质粒大量制备后浓度与纯度测定
• 3.2 稳定细胞系的构建与鉴定
• 3.2.1 干扰后Western Blot检测被干扰蛋白的干扰效率
• 3.3 饥饿应激下mTOR和自吞噬活性检测
• 3.3.1 Western Blot检测血清饥饿不同时间点mTOR的活性变化
• 3.3.2 免疫荧光观察血清饥饿不同时间点LC3的表达量
• 3.3.3 血清饥饿条件下,在自吞噬受损细胞中检测mTOR的重新激活
• 3.4 饥饿应激下,细胞外氨基酸和氨基酸转运体对mTOR活性影响的检测
• 3.4.1 血清和氨基酸同时饥饿时,检测mTOR活性变化
• 3.4.2 血清饥饿条件下,氨基酸转运体受到抑制时, mTOR活性的变化
• 3.4.3 血清饥饿条件下,mTOR重新激活对氨基酸转运体表达量的调控
• 3.5 饥饿应激下,mTOR和自吞噬活性的变化对细胞存活率的影响
• 3.5.1 血清饥饿应激下,mTOR和自吞噬活性状态对细胞存活率的影响
• 3.5.2 血清饥饿条件下,检测Bcl2的表达量变化
• 第四部分 讨论与小结
• 4.1 讨论
• 4.1.1 饥饿条件下mTOR的重新激活受细胞自吞噬的调节
• 4.1.2 饥饿条件下mTOR的重新激活需要胞外氨基酸的参与
• 4.1.3 饥饿条件下mTOR的活性和部分氨基酸转运体相互调节
• 4.2 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 在读期间发表的论文