论文摘要
目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（diabetic melliutus,DM）肾脏微血管并发症,在西方发达国家是导致终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）的主要原因,预测也将成为发展中国家ESRD的主要病因。因此,有效防治DN的发生和发展具有重要意义。多年来,国内外肾脏病学者在一直不断地探索糖尿病肾病的发病机理及治疗方法,但目前发病机制尚未十分明了,也未找到有效的治疗方法,因此寻找防止或延缓糖尿病肾病发生发展的有效途径和方法已成为世界范围的重大课题。近十几年来我国中医药界也广泛的开展了中医药防治糖尿病肾病的研究,且逐渐显示出较大的潜力和广阔的运用前景。在前期临床实践中,我们根据中医学病机理论,结合糖尿病肾病的临床特征、发病机制及其病理特点,逐步认识到该病的病情虽然复杂,但在早期和中期大多以气阴两虚、瘀血阻络、癥瘕积聚为其基本病机,治疗当以益气养阴、化瘀软坚、消癥通络为主,为此我们结合多年的临床用药经验,拟定了以益气养阴、消癥通络为主的中药复方制剂,主要药物有黄芪、玄参、鳖甲、地龙等。用该方在临床上治疗早中期的糖尿病肾病,取得了良好的临床疗效。为了进一步证实该方的治疗作用,探讨其可能的机制,进行了本项研究。首先开展了临床试验,对该药进行临床评价。在此基础上借助糖尿病肾病动物模型,观察其对肾组织肾素--血管紧张素系统的影响,为其临床应用及最终开发提供实验基础和理论依据。方法:1益气养阴消癥通络中药治疗糖尿病肾病临床研究选择Ⅲ期DN患者81例,将病例随机分为益气养阴消癥通络中药组（治疗组）41例和贝那普利组（对照组）40例,治疗组予益气养阴消癥通络中药,每日1付,水煎400ml,分2次口服;对照组予贝那普利10mg/次,1次/d。疗程三个月。所有患者于用药前和疗程结束后分别检测尿微量白蛋白排泄率（UAER）、血β2-微球蛋白（β2-MG）、尿β2-微球蛋白（β2-MG）、尿α1-微球蛋白（α1-MG）、血浆纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体（D-D）,并记录患者的症状、体征及积分情况。2益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠干预作用健康雄性SD大鼠46只,适用性饲养一周。按体重随机分为正常组（Normal）10只,造模组36只。除正常组外,造模组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ） 60 mg/kg,正常组注射相应量生理盐水,72小时后测血糖,以≥16.7mmol/L为DM模型成模标准。造模组在DM模型成模后,随机分为模型组（Model）、贝那普利组（Benazepril）、中药（ZY）组各12只。成模一周后开始给药,正常组、模型组每天每只大鼠2毫升生理盐水灌胃,治疗各组按成人剂量的20倍给药,即贝那普利组予贝那普利10mg/kg.d灌胃,中药组予中药煎剂26g/kg.d灌胃,每日一次,连续给药23周。于治疗开始后23周末收集24小时尿液,杀检动物,留取血、肾组织,测定实验动物的24小时尿蛋白定量、糖化血红蛋白、血脂、肾功能、观察肾组织超微结构变化及Ⅳ型胶原（CollagenⅣ,Col-Ⅳ）的表达。3益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠肾素-血管紧张素系统的影响同上方法复制糖尿病肾病大鼠模型,于成功复制糖尿病肾病模型24周末留取肾组织标本,放射免疫法测定大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的含量、采用紫外分光光度法测定血管紧张素转化酶（ACE）活性,免疫组织化学法和RT-PCR法检测大鼠肾组织中血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）、ACE、血管紧张素转化酶相关羧肽酶（ACE2）蛋白和基因的表达。结果:1益气养阴消癥通络中药治疗糖尿病肾病临床研究1.1两组患者治疗前后证候积分比较:治疗组与对照组在治疗前证候积分比较,差异无显著性（P >0.05）,具有可比性。治疗组与对照组治疗后与治疗前比较,差异有显著性（P <0.01）。治疗组与对照组治疗后差异有显著性（P <0.01）。1.2两组中医证候疗效比较:治疗组与对照组治疗后证候疗效比较,治疗组在改善症状方面明显优于对照组。差异有显著性（P <0.01）。1.3两组总体疗效比较:治疗组与对照组治疗后总体疗效比较,治疗组总体疗效明显优于对照组。差异有显著性（P <0.01）。1.4两组治疗前后UAER、血尿β2-MG及尿α1-MG、FIB、D-D比较:两组治疗后UAER、血β2-MG、尿β2-MG、尿α1-MG均有所降低,与治疗前相比,差异有显著性（P <0.05或P <0.01）。治疗后治疗组UAER、血β2-MG、尿β2-MG、尿α1-MG与对照组比较均有所降低,差异有显著性（P <0.05）。治疗组治疗后FIB、D-D与治疗前比较,差异有显著性（P <0.01）。且治疗后治疗组FIB、D-D与对照组比较,显著下降,差异有显著性（P <0.01）。对照组治疗前后比较,差异无显著性（P >0.05）。1.5治疗前、后两组的血脂情况比较:治疗组治疗后TC、TG、LDL均有所降低,HDL升高,与治疗前相比,差异有统计学意义（P <0.01）。治疗后治疗组TC、LDL与对照组比较均有所降低,HDL升高,差异有显著性（P <0.01）。对照组治疗后TG与治疗前比较,差异有显著性（P <0.01）。对照组TC、LDL、HDL治疗前后比较,差异无显著性（P >0.05）。1.6治疗前、后两组的血糖、糖化血红蛋白情况比较两组空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）治疗前后差异均无显著性（P >0.05）,组间比较差异无显著性（P >O.05）。2益气养阴消癥通络中药治疗糖尿病肾病大鼠疗效观察2.1各组大鼠24h尿蛋白定量的比较结果显示:24h尿蛋白定量,模型组、贝那普利组、中药组与正常组比较均明显升高（P<0.01）,贝那普利组、中药组与模型组比较明显降低（P<0.01）,而贝那普利组与中药组之间无显著差异（P>0.05）。2.2各组大鼠糖化血红蛋白（HbA1C）的比较结果显示:模型组、贝那普利组、中药组大鼠糖化血红蛋白与正常组相比明显升高（P<0.01）,而模型组、贝那普利组、中药组之间无显著性差异（P>0.05）。2.3各组大鼠血脂的比较结果显示:模型组、贝那普利组、中药组血清总胆固醇（TC）明显高于正常组（P<0.01）,中药组则比模型组明显偏低（P<0.01）,模型组与贝那普利组之间比较无显著性差异（P>0.05）。甘油三酯（TG）,两治疗组与正常组均明显低于模型组（P<0.01）,而两治疗组与正常组之间无显著性差异（P>0.05）。2.4各组大鼠肾功能的比较结果显示:两个治疗组与正常组的血肌酐（Scr）明显低于模型组（P<0.01）,贝那普利组与正常组相比明显升高（P<0.05）,而中药组与正常组之间无显著性差异（P>0.05）;尿素氮（BUN）,两治疗组与正常组均明显低于模型组（P<0.01）,而与正常组比较,贝那普利组和中药组的BUN则明显升高（P<0.05）,两治疗组之间则无显著性差异（P>0.05）。2.5肾脏病理形态学观察正常组肾小球结构完整,未见肾小球肥大,肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常改变;模型组可见肾小球肥大,肾小球毛细血管基底膜增厚,肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多,系膜区增宽;部分肾小管发生空泡变性,肾小管萎缩,透明管型形成;贝那普利组与中药组也均有不同程度病理改变,但与模型组相比病变减轻。2.6电镜结果正常组肾脏组织结构正常,肾小球基底膜均匀无增厚,上皮足突分布均匀,模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜高度增厚,大部分呈匀质样增厚,部分增生呈丘状隆起;足细胞足突广泛融合;内皮细胞高度融合,窗口大部分消失。贝那普利组与中药组大鼠肾小球毛细血管基底膜较正常呈匀质样增厚,足细胞局部融合,内皮细胞部分融合,窗口部分消失。2.7 Col-Ⅳ免疫组化检测结果。正常组Col-Ⅳ在系膜基质及基底膜及包曼氏囊有基础表达。与正常组相比,模型组Col-Ⅳ表达的范围和强度明显扩大和增强（P<0.01）;而中药组、贝那普利组与模型组相比,其表达显著下降（P<0.01）中药组与贝那普利组比较无显著性差异（P>0.05）。3益气养阴消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠肾素-血管紧张素系统的影响3.1对大鼠肾组织AngⅡ含量的影响结果显示:模型组、贝那普利组和中药组大鼠肾组织AngⅡ的含量比正常组显著升高（P<0.01）;而与模型组比较,贝那普利组和中药组大鼠肾组织AngⅡ含量则明显降低（P<0.05）;贝那普利组和中药组比较则无明显差异（P>0.05）。3.2对大鼠肾组织AT1R蛋白表达及基因表达的影响免疫组化结果显示:与正常组相比,模型组和各治疗组AT1R蛋白表达明显升高（P<0.01）,而与模型组比较,贝那普利组和中药组大鼠肾组织AT1R蛋白表达则明显降低（P<0.01）;贝那普利组和中药组比较则无明显差异（P>0.05）。RT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组和各治疗组AT1R基因表达明显升高（P<0.01）,而与模型组比较,贝那普利组和中药组大鼠肾组织AT1R基因表达则明显降低（P<0.01）;贝那普利组和中药组比较则无明显差异（P>0.05）。3.3 ACE活性检测结果结果显示:模型组大鼠肾组织ACE活性比正常组显著升高（P<0.01）,贝那普利组和中药组则比正常组明显降低（P<0.05）,而与模型组比较,贝那普利组和中药组大鼠肾组织ACE活性则明显降低（P<0.01）;贝那普利组和中药组比较则无明显差异（P>0.05）。3.4对大鼠肾组织ACE蛋白表达及基因表达的影响免疫组化染色显示:与正常组相比,模型组和各治疗组表达明显降低（P<0.01）,模型组、中药组、贝那普利组大鼠肾组织ACE表达无明显差异（P>0.05）。RT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组和各治疗组表达明显降低（P<0.01）,模型组、贝那普利组、中药组大鼠肾组织ACE表达则则无明显差异（P>0.05）。3.5对大鼠肾组织ACE2蛋白表达及基因表达的影响免疫组化染色显示:与正常组相比,模型组和各治疗组表达明显降低（P<0.01）,与模型组比较,中药组大鼠肾组织ACE2表达则明显升高（P<0.05）、而贝那普利组则无明显差异（P>0.05）,与贝那普利组比较,中药组大鼠肾组织ACE2表达则明显升高（P<0.05）。RT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组和各治疗组表达明显降低（P<0.01）,与模型组比较,中药组大鼠肾组织ACE2表达则明显升高（P<0.01）、而贝那普利组则无明显差异（P>0.05）,与贝那普利组比较,中药组大鼠肾组织ACE2表达则明显升高（P<0.05）。结论:1益气养阴消癥通络中药可显著改善早期DN患者的临床症状、体征,对早期DN的证候疗效和总体疗效均明显高于对照组。2益气养阴消癥通络中药有良好的调节脂质代谢,改善早期DN患者高凝状态,明显降低其尿微量白蛋白排泄率,并能显著减少早期DN患者血β2-微球蛋白、尿β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白的漏出,减少尿蛋白排泄,保护肾功能,从而起到预防和减缓DN发生和发展的作用。3益气养阴消癥通络中药能降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白,改善脂质代谢,改善肾功能,减轻肾组织病理损害。可降低糖尿病肾病大鼠IV型胶原合成,从而阻止肾小球硬化的发生和发展。4益气养阴消癥通络中药可以明显降低DN大鼠肾组织中AngⅡ的含量,提示其可能通过降低肾组织AngⅡ而达到抗纤维化、保护肾功能的作用。5益气养阴消癥通络中药可以降低DN大鼠肾组织中ACE活性,从而使缩血管物质AngⅡ生成减少,又可以明显升高大鼠肾组织中ACE2蛋白及基因的表达,说明益气养阴消癥通络中药可能通过维持二者的平衡,从而调节循环和局部血管舒缩的平衡,维持肾血流量和水盐代谢稳定,最终达到抗纤维化、保护肾功能的作用。
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