以小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究

论文摘要

目的:研究人的小耳残耳软骨细胞体外培养的方法及细胞的生物学特性。方法:取5～6岁小耳畸形患者的残耳软骨,采用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化后,接种于含有胎牛血清的Ham F-12培养基,进行体外培养,同时观察其形态学改变。采用Ⅱ型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定,RT-PCR检测各代细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达。结果:体外培养的小耳残耳软骨细胞的原代和早期传代细胞以多角形或者三角形为主,随着传代次数的增加,细胞逐渐变为长梭形,到第5代时,几乎全部转变为梭形细胞。而且与正常耳廓软骨细胞相比,小耳残耳软骨细胞去分化的现象更为显著。第1～3代软骨细胞的Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色阳性。在第1～2代细胞中,Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA表达水平较强,随传代次数增加,表达逐渐减弱,至第4代基本消失。结论:体外培养的第1～2代小耳畸形患者的残耳软骨细胞可作为组织工程软骨的种子细胞。目的:观察年龄因素对体外培养的小耳残耳软骨细胞生物学特性的影响。方法:取不同年龄组小耳畸形患者的残耳软骨,分离出软骨细胞并进行培养,观察其形态学改变,测定细胞群体培增的时间。Ⅱ型胶原抗体的免疫组化染色进行细胞来源的鉴定。采用RT-PCR对各年龄组小耳残耳软骨细胞的Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA表达进行检测,并进行比较。结果:各年龄组小耳畸形患者的残耳软骨细胞在细胞形态、细胞倍增时间、Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达方面均无显著差异。体外培养的小耳残耳软骨细胞随着传代次数的增加,从多角形逐渐变为长梭形。到第5代时,几乎全部转变成梭形细胞。细胞倍增时间显示,各年龄组的第1～3代细胞有旺盛的增殖力。各年龄组第1～3代细胞的免疫组织化学染色均为阳性,1代和第2代细胞的Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA表达水平相对较高,第3代的表达明显下降,第4代起均不表达。结论:体外培养的人小耳残耳软骨细胞的生物学特性不因年龄不同（6～30岁）而改变,各年龄段（＜30岁）的第1和第2代小耳残耳软骨细胞可作为软骨组织工程的种子细胞。目的:观察碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）对体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖的影响。方法:取小耳畸形患者的残耳软骨,用含5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml 4种浓度b-FGF的Ham F-12培养液进行体外培养。采用MTT法观察b-FGF对细胞增殖的影响,RT-PCR法检测b-FGF对体外培养的小耳残耳软骨细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan分泌方面影响。结果:在含有b-FGF的培养液中培养的小耳残耳软骨细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长,细胞的增殖速度明显加快（P＜0.05）,但在10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml 3种不同浓度b-FGF组之间,细胞增殖无显著差异（P＞0.05）,RT-PCR结果显示,各组的第3代软骨细胞仍存在Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达。结论:b-FGF能够促进体外培养的小耳残耳软骨细胞增殖,在2代之内,细胞的表型和功能并没有改变。10 ng/ml为b-FGF在小耳残耳软骨细胞体外培养中的最佳浓度。目的:探讨利用小耳畸形患者的残耳软骨细胞为种子细胞,在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法:获取小耳畸形患者的残耳软骨,并以正常耳廓软骨作为对照,用含10 ng/ml b-FGF的培养液分别进行体外培养。将体外培养扩增的第2代小耳残耳软骨细胞以及正常耳廓软骨细胞以50×106/ml的浓度与30%的Pluronic F-127混匀,分别注入到裸鼠的皮下,在8周时将标本分离取出,通过大体观察、组织学、免疫组织化学染色等方法对新生成的软骨进行初步的评价。结果:组织学检测显示,两种类型的软骨细胞均生成了新的软骨组织,该组织中细胞分布均匀,包埋在软骨陷窝内,有同源软骨细胞现象,可视为成熟的软骨组织,免疫组织化学染色显示,有特异性的Ⅱ型胶原分泌。结论:以体外培养的第2代小耳残耳软骨细胞为种子细胞,可注射性生物材料Pluronic F-127为支架,能够在裸鼠体内成功地构建出组织工程软骨。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人小耳残耳软骨细胞体外培养及生物学特性的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 不同年龄患者的小耳残耳软骨细胞体外培养及其生物学特性研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 碱性成纤维细胞生长因子在小耳残耳软骨细胞体外培养中的作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 小耳残耳软骨细胞为种子细胞的组织工程软骨的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 博士后在站期间发表及待发表论文