盐酸苯环壬酯及其旋光异构体对NMDA神经毒性的保护效应及其作用机制

论文摘要

盐酸苯环壬酯（phencynonate hydrochloride，PCH），商品名“飞赛乐”，是我所合成的中枢性抗胆碱能药物，用于晕动病的治疗，具有疗效强，中枢不良反应少的特点。已有研究提示苯环壬酯兼具有抗胆碱能和抗NMDA作用。由于其分子结构中存在一个手性碳原子，苯环壬酯具有R（-）和S（+）两种不同构象。不同旋光异构体对抗NMDA的效应是否存在差异，其机制如何，目前尚不清楚。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，参与中枢兴奋性突触传递，与突触可塑性和长时程增强等重要生理过程有关。其受体可分为促离子型和促代谢型两种。N-甲基—D—天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体属于离子型谷氨酸受体。包括NMDA受体在内的谷氨酸受体的正常活性为维持生理功能所必需，然而其持续过度的活化却会导致神经元的死亡，这是急性脑损伤诸如癫痫、中风之后神经细胞死亡的重要原因，也是许多慢性神经退行性病变，如帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、亨廷顿舞蹈病（Huntington’s disease，HD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）等的发病及病程发展中的重要因素。不同的药物可通过不同的途径发挥抗兴奋性毒性的作用。然而，苯环壬酯及其异构体通过何种机制达到神经保护作用尚无研究报道。本研究通过比较PCH消旋体、R（-）-PCH和S（+）-PCH的抗NMDA神经毒性效应及其对大鼠心血管和呼吸系统的影响，旨在找到保护效应强，不良反应少的优性异构体，为其进一步的合理开发利用提供研究参考，进而为NMDA相关疾病的治疗提供新的药物选择；同时对其可能保护机制进行探索，为今后的研究奠定基础。1盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性保护作用的比较NMDA致死模型是检验药物是否具有拮抗NMDA活性的唯一药理终结点，具有可靠性强，易重复的特点，该致死效应只能被苯环利定样药物和特异性NMDA受体拮抗剂阻断。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜镉细胞瘤细胞，在神经生长因子（nerve growth factor）作用下细胞表达功能性的NMDA受体，广泛用于细胞膜信号转导与细胞内信使、兴奋性神经毒性和神经保护机制的研究。本研究建立NMDA的小鼠致死模型和PC12细胞损伤模型，通过并比较PCH不同旋光异构体的神经保护作用，旨在找到保护效应更强的优性异构体，进而为NMDA相关疾病的治疗提供新的药物选择。结果表明，PCH不同旋光异构体在体内外均可对抗NMDA的损伤效应。R（-）-PCH可以对抗NDMA的致死效应，显著提高小鼠存活率，保护效应优于S（+）-PCH；PCH消旋体的最佳保护效应与R（-）-PCH相当，但所需剂量高于R（-）-PCH。细胞存活率（MTT法）和LDH漏出检测结果表明，R（-）-PCH可以显著提高NMDA损伤作用后的细胞存活率，并有效抑制NMDA所致的细胞LDH漏出增加；S（+）-PCH对NMDA损伤后的细胞存活率无明显影响，但可以有效抑制LDH的漏出；PCH消旋体的保护作用介于二者之间。R（-）-PCH和PCH消旋体可明显改善NMDA引起的细胞形态学病理改变，S（+）-PCH对形态学改变的保护作用相对较弱。2盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性的保护作用机制NMDA受体的过度激活导致胞内Ca2+超载并超出线粒体的承受能力，干扰了电子传递从而导致活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成。研究发现线粒体去极化的程度和Ca2+稳态失衡的程度呈现高度的一致性，但上述相关性并不能被ROS的过量生成所解释。为检验PCH的保护作用机制是否与阻断NMDA所致的上述病理性改变有关，本研究对上述指标及其相互关系进行了研究。药物处理后的PC12细胞分别用相应的荧光探针（Hoechst 33258、Fluo-3／AM、Rhodamine 123、DCFH-DA）标记，采用激光共聚焦系统软件Laserpix5.0程序采集处理细胞相差图像及荧光图像，并测定细胞平均荧光强度值。结果表明，PCH不同旋光异构体对NMDA所致的PC12细胞凋亡、胞内Ca2+稳态失衡、线粒体膜电位降低、ROS过量生成均有对抗作用。R（-）-PCH在抑制NMDA所致的上述细胞内稳态变化方面均显示出比S（+）-PCH更强的保护效应，与NMDA受体非特异性拮抗剂MK-801作用相当；PCH消旋体作用介于两种旋光异构体之间，也显示出显著性保护作用；而S（+）PCH只对凋亡和ROS生成有显著性抑制作用。结合第一部分实验结果，R（-）-PCH可以显著提高小鼠和PC12细胞存活率，而S（+）-PCH却无明显效应，不难得出：对Ca2+超载和线粒体去极化的阻滞在PCH及其异构体的保护作用机制中起重要作用，对ROS生成的阻滞在保护机制中并不发挥主要作用。3盐酸苯环壬酯及其异构体对大鼠心血管和呼吸系统的影响本研究对PCH不同旋光异构体对大鼠心血管和呼吸系统的影响进行比较，旨在找到不良反应少的优性异构体，从而为NMDA相关疾病的治疗提供新的药物选择。Wistar大鼠随机分为10组，每组10只，雌雄各半，分别设为R（-）PCH、S（+）PCH和PCH消旋体3.5、7、14mg／kg 3个剂量组和生理盐水对照1组。动物分离左侧股总动脉作动脉插管同时气管插管，单次灌胃给药后记录血压、心电图和心率，描记呼吸波形、记录呼吸频率及潮气量。以每个时间点60s内平均值作为评价指标。再以每组动物各个时间点上平均值的平均值和标准差与对照组进行比较。结果显示，R（-）PCH、S（+）PCH和PCH消旋体对大鼠呼吸频率、潮气量和心率无明显影响，不同旋光异构体对血压均有降低趋势，但剂量效应关系不明显。综上，PCH不同旋光异构体在体内外均能对抗NMDA的神经毒性作用。R（-）-PCH在体内体外的保护效应均优于S（+）-PCH，保护作用与MK-801相当，是优性异构体，PCH消旋体的作用介于两个旋光异构体之间；抑制胞内Ca2+超载和线粒体的去极化在PCH及其异构体的保护作用机制中起重要作用；在本实验条件下R（-）PCH、S（+）PCH和PCH消旋体对大鼠呼吸频率、潮气量和心率无明显影响，不同旋光异构体对血压均有降低趋势，但剂量效应关系不明显。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性的保护作用的比较研究材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 小结
• 第二部分 盐酸苯环壬酯及其异构体抗NMDA神经毒性的保护作用机制材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 小结
• 第三部分 盐酸苯环壬酯及其异构体对大鼠心血管和呼吸系统的影响材料与方法
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果与讨论
• 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述