microRNA对多巴胺能神经元分析化基因的调节作用

论文摘要

帕金森氏病（Parkinson’s disease, PD）是由于缓慢发生的中脑黑质多巴胺能神经元选择性死亡和纹状体多巴胺含量显著减少所导致,PD已成为发病率高居第二的神经系统退行性疾病。显而易见,多巴胺能神经元（dopaminergic neuron, DA neuron）数量的锐减导致其所释放的DA递质含量不足,进而引起运动失调,是PD产生的根本原因。所以,通过合适的途径调控体内DA神经元的数量,从而恢复神经递质平衡是治疗PD的关键所在。microRNAs（miRNAs）是一类长度约为20-25nt的内源性非编码小分子RNA,可通过与靶mRNA的3’UTR区互补配对而在转录后水平负调控基因表达。近期的众多研究都着眼于此类小分子RNA家族在疾病产生及治疗方面的重要作用。本文基于现有的研究基础,将三个与多巴胺能神经元分化相关的关键基因——Lmxla、Msx1和Nr4a2/Nurrl作为研究对象。利用Microcosm Targets、MicroRNA.org、TargetScan和miRDB等四款miRNA在线分析软件进行生物信息学预测,搜索筛选出对三个靶基因具有调控作用的miRNAs,再经过萤光素酶双报告基因检测（Dual-luciferase assays system）和Western Blotting对软件预测结果进行实验验证,结果小结如下：1、通过文献查找,选定Lmxla、Msx1和Nr4a2/Nurr1三个与多巴胺能神经元分化密切相关的基因作为研究对象。以这三个基因的3’UTR为靶序列,在四款miRNA数据库中进行生物信息学预测,搜索出可能调控这三个靶序列的miRNAs。选取四款软件或至少三款软件均能预测到的miRNAs作为候选miRNAs。其中,预测对Lmx1a有作用的miRNAs有3个；预测对Msx1有作用的miRNAs有4个；预测对Nr4a2/Nurr1有作用的miRNAs有13个。2、克隆Lmxla、Msx1和Nr4a2/Nurr1三个靶基因3’UTR序列到psiCHECK-2载体中,克隆miR-9、miR-19b、miR-19a、miR-17、miR-20a、miR-106b、miR-211、miR-206、miR-183、miR-34a、miR-467b、miR-144、miR-374、miR-29a、miR-30e、miR-30b、miR-384-5p,17个miRNAs到T载体中。3、利用小鼠的胚胎神经干细胞作为转染对象,共转染已构建的候选miRNAs及携带靶基因3’UTR序列的萤光素酶双报告基因载体。利用Dual-luciferase assays system,分析海肾萤光素酶（Rluc）报告基因的表达水平,发现预测的miRNAs中,除miR-206/Nr4a2、miR-467b/Lmxla、miR-374/Msx1三个实验组无差异显著的结果外,其他miRNAs均与预测结果一致,对靶基因3’UTR具有明显抑制作用。4、利用小鼠的胚胎神经干细胞作为转染对象,单独转染已构建的候选miRNAs载体,提取蛋白进行Western Blotting检测。发现Nr4a2组的各miRNAs都能够显著降低靶基因的蛋白水平,进一步证实了预测结果。而Lmxla和Msx1纽的抑制效果没有Nr4a2组明显。经过上述验证,我们可以肯定miRNA参与调控多巴胺能神经元分化相关基因的表达,并通过靶向这些基因而间接调节多巴胺能神经元的分化,从而参与帕金森氏病的发生。本研究不但证实了miRNA与帕金森氏病病的发生之间存在莫大的联系,还为帕金森氏病病的治愈及新药的研发提供了一个新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 立题的背景和意义
• 1.2 帕金森氏病的介绍
• 1.2.1 帕金森氏病的发病机制及病理特征
• 1.2.2 多巴胺及多巴胺能神经元
• 1.2.3 多巴胺能神经元相关的分化基因
• 1.3 microRNA的介绍
• 1.3.1 microRNA的发现
• 1.3.2 microRNA的生物合成机制
• 1.3.3 microRNA的特征
• 1.3.4 microRNA的作用机制及靶基因预测
• 1.3.4.1 microRNA的作用机制
• 1.3.4.2 microRNA靶基因预测
• 1.3.5 microRNA对帕金森氏病的影响
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 仪器和设备
• 2.1.2 试剂和耗材
• 2.1.3 引物和测序
• 2.1.4 动物、细胞和质粒
• 2.2 计算机分析
• 第3章 实验方法
• 3.1 实验技术路线
• 3.2 靶基因的确定及对其具有调控作用的miRNA预测
• 3.3 靶基因克隆
• 3.3.1 小鼠神经干细胞（NPC）的培养
• 3.3.2 PCR扩增靶基因及琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3.3 靶基因割胶回收
• 3.3.4 靶基因与载体PsiCHECK-2的酶切和酶连
• 3.3.5 转化
• 3.3.6 单克隆菌落培养及测序
• 3.3.7 克隆菌落测序结果比对及质粒提取、鉴定
• 3.4 miRNA克隆
• 3.4.1 lenti-137质粒提取（BIOMIGA质粒小提试剂盒）
• 3.4.2 PCR扩增miRNA及琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.4.3 纯化产物加A尾
• 3.4.4 miRNA的TA克隆及重组质粒转化大肠杆菌
• 3.4.5 单克隆菌落培养及测序
• 3.4.6 miRNA单克隆菌落测序结果比对及质粒提取、鉴定
• 3.5 细胞转染
• 3.5.1 小鼠神经干细胞（NPC）的培养
• 3.5.2 小鼠神经干细胞（NPC）的贴壁培养
• 3.5.3 靶基因和miRNA共转染NPC
• 3.5.4 luciferase检测（Promega）
• 3.6 Western Blotting检测靶基因目的蛋白表达
• 3.6.1 小鼠神经干细胞（NPC）的培养
• 3.6.2 小鼠神经干细胞（NPC）的贴壁培养
• 3.6.3 miRNA转染NPC
• 3.6.4 Western Blotting检测
• 第4章 结果与分析
• 4.1 生物信息学预测对靶基因具有调控作用的miRNA
• 4.1.1 Microcosm Targets database预测结果
• 4.1.2 MicroRNA.org预测结果
• 4.1.3 TargetScan.预测结果
• 4.1.4 miRanda预测结果
• 4.1.5 初步筛选miRNA作为候选研究对象
• 4.2 靶基因克隆
• 4.2.1 小鼠NPC培养图谱
• 4.2.2 基因组DNA的提取
• 4.2.3 靶基因的PCR扩增
• 4.2.4 靶基因的单克隆菌液测序结果比对
• 4.2.5 靶基因阳性克隆的质粒提取
• 4.3 miRNA克隆
• 4.3.1 miRNA的PCR扩增
• 4.3.2 miRNA阳性克隆的质粒提取
• 4.4 萤光素双报告基因检测
• 4.4.1 神经干细胞（NPC）的贴壁培养
• 4.4.2 靶基因和miRNA共转染后Luciferase检测结果
• 4.5 Western Blotting检测目的基因表达
• 第5章 讨论
• 5.1 生物信息学预测方法在RNA组学研究中的可行性
• 5.2 DA神经元相关分化基因与miRNAs之间存在相关性
• 5.3 以miRNAs为靶标治疗疾病的希望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果