论文摘要
随着我国人口老龄化进程加快,脑血管意外已成为我国第二大死亡疾病,其中缺血性脑卒中约占70%～80%。脑缺血/再灌注损伤造成不同程度神经功能障碍,严重影响患者生存质量,甚至危及生命。如何防治脑缺血/再灌注损伤,寻找有效的治疗药物及措施,促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复,一直是生命科学研究的重点和热点。研究发现,缺血前给予一定的预处理措施,能有效地减轻缺血后的损伤,即缺血耐受。近年来,已发现众多不同的刺激都能诱导出相似的缺血耐受效应,说明不同的应激原活化的信号通路极有可能汇聚于一些共同的下游通路,通过基本的调节机制最终诱发保护作用。JAK-STAT通路是能够将细胞外信号快速传递至细胞内的信号转导途径。但是,有关该通路在脑缺血再灌注后活化的机制及其效应等诸多问题尚未明确。本研究以STAT3蛋白为立足点,采用大鼠大脑中动脉阻闭（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）模型,利用形态学和分子生物化学技术,探讨JAK-STAT通路激活的特征、影响因素和活化后效应,并初步探讨其在高压氧（HBO）预处理保护效应中的作用。本研究由两部分组成:第一部分为脑缺血再灌注后STAT3分子的活化机制和效应研究,目的是研究缺血再灌注损伤后STAT3的活化特点、机制及其效应;第二部分为STAT3活化在HBO预处理脑保护效应中的作用研究,目的是研究STAT3是否参与了HBO预处理诱导的脑保护效应。第一部分脑缺血再灌注后STAT3分子活化的定位、影响因素和效应研究方法1.脑缺血再灌注后STAT3的磷酸化（pSTAT3）清洁级雄性SD大鼠18只（280-320g）,随机分为2组:假手术组（Sham）和大脑中动脉阻闭阻（MCAO）。动物经历2h缺血后分别于再灌注30min、2h和24h处死,进行蛋白免疫印迹（Western blotting）,检测缺血再灌注后STAT3的活化情况。2.缺血再灌注后pSTAT3阳性细胞的分布和细胞定位雄性SD大鼠18只,分组同1。缺血2h再灌注30min、2h和24h后将动物处死,进行免疫组化和免疫荧光双标染色。3.缺血再灌注后STAT3活化的细胞与血管的关系雄性SD大鼠16只,分组同1。缺血2h再灌注24h后将动物处死,单宁酸染色显示脑内各级血管,HE衬染以显示细胞,免疫组化染色显示pSTAT3表达,观察缺血再灌注后pSTAT3的表达与血管分布的关系。4. STAT3活化与缺血时间的关系雄性SD大鼠12只随机分成4组:缺血30min再灌注120min组（I30/R120）,缺血60min再灌注120min组（I60/R120）,缺血120min再灌注120min组（I120/R120）和单纯缺血组120min组（I120/R0）。Western blotting检测不同组动物pSTAT3的差别。5.单纯缺血损伤和缺血+再灌注损伤对STAT3活化水平的影响18只雄性SD大鼠随即分成6组:150min单纯缺血组（I150）,150min缺血/再灌注组（缺血30min+再灌注120min, I30/R120）;180min单纯缺血组（I180）,180min缺血/再灌注组（缺血60min+再灌注120min, I60/R120）;240min单纯缺血组（I240）,240min缺血/再灌注组（缺血120min+再灌注120min, I120/R120）。Western blotting检测pSTAT3的差别。6. ROS在STAT3活化中的作用15只SD大鼠分成5组:对照组,生理盐水组（给予5ml/Kg生理盐水,NS）,DMTU1（5%,5ml/Kg）,DMTU2（10%,5ml/Kg）,DMTU3（20%,5ml/Kg）,均在缺血前1h给予。缺血2h,再灌注24h进行Western blotting检测pSTAT3的差别。7.酪氨酸磷酸化抑制剂AG490对局灶性脑缺血损伤的影响7.1. AG490抑制STAT3磷酸化的有效剂量确定缺血前20min侧脑室注射给予不同浓度酪氨酸磷酸化抑制剂AG490,确定其能够抑制STAT3磷酸化的有效剂量。15只SD大鼠随即分成5组:对照组,DMSO组（3%DMSO）,AG490-1（250μM,10μL）,AG490-2（500μM,10μL）AG490-3（1000μM,10μL）。再灌注24h取材进行Western blotting。7.2. AG490对对局灶性脑缺血损伤的影响雄性SD大鼠30只,随机分为3组:空白对照组;3%DMSO组:缺血前20min给予3%DMTU侧脑室注射;AG490组:缺血前20min给予AG490侧脑室注射。分别于再灌注24h、48h和72h行Garcia神经功能障碍评分。72h处死动物,TTC染色测定梗死容积。结果1.脑缺血再灌注后STAT3的活化、分布特征、细胞定位及与血管分布的关系Western显示,假手术组动物缺血侧皮质与海马均未见磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白的染色条带。MCAO组动物缺血2h,再灌注30min、2h和24h后缺血侧皮质和海马组织中STAT3磷酸化水平（pSTAT3/STAT3比值）显著升高（P<0.05）。再灌注30min和2h组织STAT3磷酸化水平无统计学差异,但再灌注24h组织STAT3磷酸化水平明显高于再灌注30min和2h时组织pSTAT3水平。提示缺血/再灌注诱发了局部STAT3的磷酸化,并在再灌注30min后开始增加,24h达到高峰。24h内再灌注时间的延长能增加STAT3的磷酸化。免疫组化显示假手术组的缺血侧及对侧前脑均未见到磷酸化STAT3样免疫反应阳性细胞。MCAO组动物的前脑出现大量pSTAT3免疫反应阳性细胞。这些细胞主要存在于缺血周边区,并存在一定的脑区和核团分布特异性。从时程上看,pSTAT3从再灌注后30min升高,至少持续至再灌注24h。各时间点pSTAT3表达变化无统计学差异。免疫荧光双标记染色显示,缺血2h再灌注24h内pSTAT3免疫反应阳性细胞主要是GFAP阳性的星形胶质细胞和NeuN阳性的神经元。OX-42阳性小胶质细胞中未检测到pSTAT3表达。用单宁酸媒染法显示局部血管,发现血管周边pSTAT3表达丰富。pSTAT3阳性细胞多围绕血管分布,这种分布特征以下丘脑室旁核和视上核表现最为明显。2.STAT3活化与缺血时间、再关注损伤和ROS的关系单纯缺血120min即能诱导出pSTAT3中度表达。缺血30min、60min和120min+再灌注120min组皮质和海马组织内,STAT3的磷酸化水平与单纯缺血120min组相比显著增加,不同缺血时间+再灌注组之间STAT3的磷酸化水平无统计学差异。提示单纯缺血可诱发脑内STAT3的活化,但一定范围内的缺血时程变化并不明显影响STAT3磷酸化的变化幅度。缺血30min、60min和120min+再灌注120min各组皮质与海马组织中的pSTAT3分别高于总时程相同,但只给予单纯缺血的相应组。其中缺血30min+再灌注120min组皮质和海马pSTAT3水平比单纯缺血150min组升高了（89±18）%和（38±1）%,缺血60min+再灌注120min组皮质和海马pSTAT3水平比单纯缺血180min组升高了（45±28）%和（56±22）%,缺血120min+再灌注120min组皮质和海马pSTAT3水平比单纯缺血240min组升高了（42±10）%和（63±11）%。提示在相同的总时程,缺血/再灌注比同样时程的单纯缺血明显增加局部pSTAT3的水平。NS组pSTAT3与对照组相比无显著差异。给予自由基清除剂各组pSTAT3水平均显著低于NS和Con组。20%DMTU组中pSTAT3最低。5%DMTU组皮质和海马pSTAT3水平与对照组相比降低了（42±12）%和（34±23）%,10%DMTU组皮质和海马pSTAT3水平与对照组相比降低了（72±2）%和（52±16）%,20%DMTU组皮质和海马pSTAT3水平与对照组相比降低了（72±6）%和（66±7）%。DMTU对STAT3活化的抑制作用呈剂量依赖性。提示缺血/再灌注过程中生成的氧自由基是STAT3激活的重要因素。3.酪氨酸磷酸化抑制剂AG490对局灶性脑缺血损伤的影响最后确定AG490-3（1000μM,10μL）为后续实验的的剂量。AG490组在再灌注各个时间点的NDS评分明显优于DMSO和对照组,而DMSO组和对照组间无显著差异。再灌注72h后,对照组脑梗死容积明显大于AG490组。对照组和DMSO组无显著差异。本结果提示STAT3的激活加剧了组织损伤。第二部分STAT3活化在HBO预处理诱导脑保护效应中的作用方法1. HBO预处理后STAT3磷酸化水平的变化72只雄性SD大鼠随机分为两组:缺血对照组（Control）:常压空气处理5d （1ATA,21%O2,每天1h, 5d）;高压氧组（HBO）:高压氧预处理5d （2.5ATA,100%O2,每天1h, 5d）。各组取18只动物,分别在末次预处理结束后30min、2h和24h行免疫组化和Western blotting检测HBO后STAT3的活化情况。末次预处理24h后,行MCAO缺血2h。再灌注30min、2h和24h后分别行免疫组化和Western blotting检测HBO预处理对缺血再灌注后STAT3磷酸化水平的影响。2.酪氨酸磷酸化抑制剂AG490对HBO预处理效应的影响40只雄性SD大鼠随机分成4组:Control:常压空气处理5天后行MCAO;HBO:高压氧预处理5天后行MCAO;HBO+DMSO:高压氧预处理5天,缺血前20min给予3%DMSO;HBO+AG490:高压氧预处理5天,缺血前20min给予1000μM AG490 10μL。再灌注的24h、48h和72h行NDS评分,72h测定梗死容积。结果1.HBO预处理后STAT3磷酸化水平的变化HBO预处理后的3个时间点均未检测到pSTAT3的表达。缺血2h再灌注30min后HBO预处理组和Con组之间pSTAT3无显著差异。再灌注2h和24h,HBO预处理组STAT3磷酸化水平显著低于Con组（P<0.05）。2.酪氨酸磷酸化抑制剂AG490对HBO预处理效应的影响HBO+AG490、HBO+DMSO组和HBO组在各个时间点NDS评分明显优于对照组,而HBO+AG490、HBO+DMSO组和HBO三组之间无显著差异。再灌注72h后,对照组脑梗死容积明显大于HBO组、HBO+DMSO组和HBO+AG490组。而HBO+AG490、HBO+DMSO组和HBO三组之间无显著差异。结论1.缺血再灌注后存在STAT3的活化,表现为STAT3磷酸化水平的增高。再灌注24h内pSTAT3主要存在于星形胶质细胞和神经元中;pSTAT3在不同脑区分布的特点与局部血管的构筑相关。2.STAT3的活化主要发生在再灌注时期,与ROS的大量产生有关。3.抑制STAT3的活化具有脑保护效应。4.HBO预处理通过减少STAT3的活化发挥脑保护作用。
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